本文關(guān)鍵詞：表達Ag85A-IL-17A重組恥垢分枝桿菌構(gòu)建及抗氣道炎癥反應(yīng)機制

  更多相關(guān)文章： 重組恥垢分枝桿菌 白介素-17A 自身抗體 氣道炎癥反應(yīng)

【摘要】：氣道炎癥反應(yīng)是多種呼吸系統(tǒng)疾病的共同病理特征,主要包括感染性氣道炎癥反應(yīng)和過敏性氣道炎癥反應(yīng)。肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是呼吸系統(tǒng)最常見的感染病原體,其感染后氣道炎癥反應(yīng)以中性粒細胞浸潤為主。哮喘則是以氣道炎性細胞浸潤、氣道高反應(yīng)性和氣道黏液分泌增加等為特征的過敏性疾病,中性粒細胞在其病理過程中也發(fā)揮重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn),Th17細胞及其分泌的細胞因子IL-17A、IL-17F等在以中性粒細胞浸潤為特征的氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此,拮抗IL-17A和IL-17F的功能成為抑制氣道炎癥反應(yīng)的重要途徑。我們對IL-17A和IL-17F與肺炎鏈球菌感染所致氣道炎癥反應(yīng)的關(guān)系進行了實驗研究,并在此基礎(chǔ)上進一步研究IL-17A和IL-17F與過敏性氣道炎癥反應(yīng)的相互關(guān)系。根據(jù)Lanre Delavallée的理論,當(dāng)自身蛋白與外源性蛋白結(jié)合,通過外源性蛋白提供Th細胞抗原表位,可激活T-B細胞反應(yīng),活化B細胞,產(chǎn)生抗自身蛋白的抗體。因此,我們設(shè)想若在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17A和IL-17F的自身抗體,抑制IL-17A和IL-17F的功能,可望有效減輕氣道炎癥反應(yīng)。恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)無致病性,且具有免疫調(diào)節(jié)功能,是基因工程疫苗的常用載體。Ag85A是卡介苗(BCG)免疫原性較強的分泌蛋白復(fù)合體Ag85的組分之一,能夠促進Th1型免疫反應(yīng)。本實驗擬構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌疫苗,以Ag85A為外源性蛋白提供Th細胞抗原表位,在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17A和IL-17F自身抗體,研究其抗氣道炎癥反應(yīng)的相關(guān)機制。目的:構(gòu)建表達Ag85A-IL-17A/F重組恥垢分枝桿菌r MS-Ag85a-IL-17a/f,體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17A和IL-17F自身抗體,并探討其抗氣道炎癥反應(yīng)相關(guān)機制。方法:本實驗擬分三步進行:(1)r MS-Ag85a-IL-17a/f的構(gòu)建及體內(nèi)誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生:利用分子克隆技術(shù),將Ag85a-IL-17a/f基因片段克隆至穿梭表達載體p MFA42S中,構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a/f,并電轉(zhuǎn)化至恥垢分枝桿菌中,獲得r MS-Ag85a-IL-17a/f。經(jīng)Western blot鑒定蛋白表達。以重組恥垢分枝桿菌鼻腔黏膜免疫小鼠,ELISA法檢測小鼠血清中抗IL-17A和IL-17F自身抗體的滴度以及肺組織勻漿中IL-5、IL-12和IL-17A等細胞因子的濃度;RT-PCR法檢測肺組織中轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3的m RNA表達情況。HE染色觀察小鼠肺組織病理改變。(2)r MS-Ag85a-IL-17a的體外功能研究:r MS-Ag85a-IL-17a體外感染小鼠巨噬細胞RAW264.7,以MS為對照組,觀察r MS-Ag85a-IL-17a對巨噬細胞凋亡、吞噬功能的影響,Griess法檢測細胞培養(yǎng)上清中NO的分泌情況,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6、MIP-1α、TNF-α、IL-10的分泌水平,RT-PCR法檢測細胞內(nèi)IL-6、IL-10、Defb-2及i NOS的m RNA表達情況。(3)r MS-Ag85a-IL-17a抗哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)機制的研究:構(gòu)建小鼠哮喘模型,以r MS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜免疫干預(yù)。實驗動物分為PBS組,哮喘組,重癥哮喘組,重癥哮喘+MS組和重癥哮喘+r MS-Ag85a-IL-17a組。瑞吉染色計數(shù)小鼠肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數(shù)及細胞分類計數(shù),并測定BALF中髓過氧化物酶(MPO)活力,HE及PAS染色觀察小鼠肺組織病理改變,ELISA法測定BALF及脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IL-5、IL-6、IL-12、IL-10、IL-13和IL-17A的濃度,流式細胞術(shù)檢測脾臟INF-γ+Th1細胞及IL-4+Th2細胞的含量,RT-PCR法檢測肺組織中IL-6、IL-10、IL-23、Eotaxin-1、MIP-2、TGF-β、T-bet、GATA3和RORγt的m RNA表達情況。結(jié)果:(1)重組質(zhì)粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a經(jīng)測序及酶切鑒定正確,質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌獲得r MS-Ag85a-IL-17a,Western blot鑒定其表達融合蛋白Ag85A-IL-17A,該融合蛋白與抗IL-17A抗體特異性結(jié)合。r MS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜免疫小鼠,可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17A自身抗體,免疫后第1周血清中開始出現(xiàn)自身抗體,第3周到達峰值,有效滴度可維持4周以上。r MS-Ag85a-IL-17a降低小鼠肺組織勻漿中IL-5和IL-17A的水平,提高IL-12的水平;上調(diào)肺組織T-bet的表達。r MS-Ag85a-IL-17f未能在小鼠體能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17F自身抗體。r IL-17F能夠增強小鼠肺部炎癥反應(yīng),減少肺炎鏈球菌在小鼠肺部的定植。(2)r MS-Ag85a-IL-17a增強巨噬細胞的吞噬功能,促進巨噬細胞的凋亡;提高巨噬細胞分泌NO、IL-6、MIP-1α及TNF-α的水平,促進細胞內(nèi)IL-6、IL-10、Defb-2及i NOS的表達。(3)r MS-Ag85a-IL-17a干預(yù)哮喘小鼠模型,與重癥哮喘組比較,r MS-Ag85a-IL-17a顯著降低哮喘小鼠BALF中白細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞及中性粒細胞的數(shù)量;降低BALF中IL-5、IL-6、IL-13和IL-17A的水平,提高IL-12的水平;降低脾細胞培養(yǎng)上清中IL-5、IL-6、IL-13和IL-17A的水平,提高IL-12、IL-10的水平;抑制BALF中MPO的活力;抑制肺組織IL-6、IL-23、Eotaxin-1、MIP-2、TGF-β和GATA3的表達,上調(diào)IL-10和T-bet的表達;流式細胞術(shù)結(jié)果提示r MS-Ag85a-IL-17a提高小鼠脾臟INF-γ+Th1細胞數(shù)量,降低IL-4+Th2細胞數(shù)量;肺組織病理結(jié)果提示r MS-Ag85a-IL-17a干預(yù)組小鼠的氣道炎癥明顯減輕,炎性細胞滲出及氣道黏液分泌減少。結(jié)論:(1)成功構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌r MS-Ag85a-IL-17a,Western blot證實其表達融合蛋白Ag85A-IL-17A。r MS-Ag85a-IL-17a能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生較高滴度的抗IL-17A自身抗體。(2)r MS-Ag85a-IL-17a加強巨噬細胞吞噬功能,促進細胞分泌炎癥介質(zhì),增強巨噬細胞抗感染能力。(3)r MS-Ag85a-IL-17a經(jīng)鼻腔黏膜免疫能夠有效減輕小鼠氣道炎癥反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：重組恥垢分枝桿菌 白介素-17A 自身抗體 氣道炎癥反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R562.25
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 縮略詞16-19
• 前言19-28
• 參考文獻23-28
• 第一章 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a/f構(gòu)建及體內(nèi)誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生28-71
• 實驗一 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a構(gòu)建及體內(nèi)誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生30-58
• 1 材料30-32
• 1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基30-31
• 1.2 酶、抗體、化學(xué)試劑、抗生素及試劑盒31
• 1.3 熒光定量PCR檢測用引物31-32
• 1.4 實驗動物32
• 1.5 主要實驗儀器32
• 2 方法32-48
• 2.1 重組大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達質(zhì)粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a構(gòu)建及鑒定32-39
• 2.2 表達Ag85A-IL-17A的重組恥垢分枝桿菌疫苗的構(gòu)建及鑒定39-42
• 2.3 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)抗IL-17A自身抗體42-48
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)分析48
• 3 結(jié)果48-58
• 3.1 重組質(zhì)粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a的構(gòu)建及鑒定48-50
• 3.2 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a的鑒定50-51
• 3.3 重組恥垢分枝桿菌與野生型恥垢分枝桿菌生長曲線的比較51-52
• 3.4 Western blot鑒定Ag85A-IL-17A在重組恥垢分枝桿菌中的表達52
• 3.5 rMS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜接種后對小鼠體重的影響52-53
• 3.6 rMS-Ag85a-IL-17a小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17A自身抗體53-54
• 3.7 小鼠肺組織勻漿中恥垢分枝桿菌CFU的變化54-55
• 3.8 rMS-Ag85a-IL-17a對小鼠肺組織勻漿中IL-5，IL-12，IL-17A表達水平的影響55
• 3.9 rMS-Ag85a-IL-17a對小鼠肺組織T-bet，GATA3 m RNA表達的影響55-56
• 3.10 rMS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜接種后小鼠肺組織病理的改變56-58
• 實驗二 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17f的構(gòu)建及相關(guān)功能研究58-66
• 1 材料58-59
• 1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基58-59
• 1.2 實驗動物59
• 1.3 化學(xué)試劑及試劑盒59
• 1.4 主要實驗儀器59
• 2 方法59-60
• 2.1 實驗動物分組59-60
• 2.2 肺泡灌洗液（BALF）的收集60
• 2.3 BALF中肺炎鏈球菌培養(yǎng)及計數(shù)60
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)分析60
• 3 結(jié)果60-62
• 3.1 小鼠BALF菌落計數(shù)60-61
• 3.2 rIL-17F對小鼠BALF細胞分類計數(shù)的影響61-62
• 4 討論62-66
• 參考文獻66-71
• 第二章 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a對小鼠巨噬細胞RAW264.7 功能的影響71-89
• 1 材料71-73
• 1.1 細胞系、菌株及培養(yǎng)基71-72
• 1.2 試劑盒及主要化學(xué)試劑72
• 1.3 熒光定量PCR檢測用引物72-73
• 1.4 主要實驗儀器73
• 2 方法73-78
• 2.1 MS及rMS-Ag85a-IL-17a菌株準(zhǔn)備及RAW264.7 細胞培養(yǎng)73-74
• 2.2 MS及rMS-Ag85a-IL-17a感染RAW264.7 細胞74-75
• 2.3 細胞培養(yǎng)上清NO濃度測定（Griess法）75-76
• 2.4 ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IL-6，IL-10，TNF-α及MIP-1α濃度76-77
• 2.5 實時熒光定量PCR法檢測細胞中IL-6，IL-10，Defb-2 及i NOS的表達77-78
• 2.6 統(tǒng)計學(xué)分析78
• 3 結(jié)果78-83
• 3.1 巨噬細胞內(nèi)CFU的比較78-79
• 3.2 rMS-Ag85a-IL-17a對巨噬細胞凋亡率的影響79-80
• 3.3 rMS-Ag85a-IL-17a對巨噬細胞分泌NO的影響80-81
• 3.4 rMS-Ag85a-IL-17a對巨噬細胞培養(yǎng)上清中IL-6，IL-10，MIP-1α 及TNF-α 表達的影響81-82
• 3.5 rMS-Ag85a-IL-17a對巨噬細胞IL-6，IL-10，Defb-2 及i NOS m RNA表達的影響82-83
• 4 討論83-85
• 參考文獻85-89
• 第三章 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a抗過敏性氣道炎癥機制研究89-123
• 1 材料89-92
• 1.1 實驗動物89-90
• 1.2 菌株及培養(yǎng)基90
• 1.3 試劑盒、抗生素及主要化學(xué)試劑90-91
• 1.4 熒光定量PCR檢測用引物91
• 1.5 主要實驗儀器91-92
• 2 方法92-101
• 2.1 菌株及實驗動物準(zhǔn)備92
• 2.2 動物免疫方案92-94
• 2.3 標(biāo)本采集及處理94-97
• 2.4 實驗指標(biāo)測定97-99
• 2.5 肺組織病理學(xué)分析99-101
• 2.6 統(tǒng)計學(xué)分析101
• 3 結(jié)果101-117
• 3.1 小鼠血清中抗IL-17A自身抗體的滴度變化101-102
• 3.2 rMS-Ag85a-IL-17a對哮喘小鼠BALF中炎性細胞的影響102-104
• 3.3 rMS-Ag85a-IL-17a對哮喘小鼠BALF中細胞因子IL-5，IL-6，IL-10，IL-12，IL-13 及IL-17A表達的影響104-106
• 3.4 rMS-Ag85a-IL-17a對哮喘小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子表達的影響106-108
• 3.5 rMS-Ag85a-IL-17a對小鼠BALF中髓過氧化物酶活力的影響108-109
• 3.6 rMS-Ag85a-IL-17a對小鼠肺組織IL-6，IL-10，IL-23，，Eotaxin-1，MIP-2，TGF-β，T-bet，GATA3和RORγt m RNA表達的影響109-110
• 3.7 rMS-Ag85a-IL-17a對小鼠脾細胞增殖的影響110-111
• 3.8 rMS-Ag85a-IL-17a對哮喘小鼠脾臟Th1和Th2細胞數(shù)量的影響111-114
• 3.9 rMS-Ag85a-IL-17a黏膜免疫后小鼠肺組織病理改變114-117
• 4 討論117-120
• 參考文獻120-123
• 第四章 全文總結(jié)123-125
• 1 研究內(nèi)容總結(jié)123
• 2 研究的創(chuàng)新點123-124
• 3 研究的意義及展望124-125
• 附錄：實驗室常規(guī)培養(yǎng)基及主要試劑配方125-128
• 致謝128-129
• 攻讀博士期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文及參加科學(xué)研究項目情況129

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐苗,陳保文,沈小兵,蘇城,羅永艾,王國治;恥垢分枝桿菌作為免疫調(diào)節(jié)劑的研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2005年09期

2 湛W歐

本文編號：643321