發(fā)布時間：2017-08-07 12:21

  本文關鍵詞：高遷移率族蛋白B1在調節(jié)支氣管哮喘氣道重塑中的作用及相關機制的研究

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【摘要】：研究背景及意義：支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種以慢性氣道炎癥、粘液高分泌和氣道高反應性為主要特征的全世界發(fā)病率最高的慢性疾病之一,對全球大約3億患者身體健康造成極大危害。盡管大部分支氣管哮喘病人的病情可以得到有效的控制,但是給全球的社會、衛(wèi)生健康系統和患者本人賦予了極大的經濟負擔。而盡早的治療氣道重塑被認為是一種潛在的能降低哮喘嚴重程度、提高哮喘控制和預防改變急性加重的措施,但是目前對于氣道重塑的發(fā)病機制仍然不是很清楚。研究已經證明炎癥因子在促進支氣管哮喘的慢性氣道炎癥和氣道結構慢性改變方面扮演重要的角色。高遷移率族蛋白B1 (HMGB1)是一種具有顯著促炎效應細胞因子。高遷移率族蛋白B1在細胞核內作為一種綁定在DNA上的非組蛋白,但它有另外一個潛在角色：作為內源性“危險信號分子”,在許多人類疾病中可以啟動和擴大固有免疫炎癥過程。大量的來源于臨床病人和動物模型的研究均支持：當HMGB1被釋放到細胞外后可以作為一種重要的促炎癥因子。事實上HMGB1在許多臨床炎癥狀態(tài)中如膿毒血癥、類風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病、系統性紅斑狼瘡等疾病均表達顯著升高。最近,我們發(fā)現了HMGB1的表達水平在支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者的血漿和誘導痰均異常升高,且HMGB1表達水平與肺功能若干指數呈負相關,而與中性粒細胞計數正相關。我們研究還表明HMGB1在OVA誘導的急性哮喘小鼠動物模型的肺組織和肺泡灌洗液中均表達上調。來自于shim的研究發(fā)現HMGB1在嗜酸性氣道炎癥過程中扮演重要角色。更具吸引力研究的是HMGB1還被發(fā)現在肺纖維化過程中非常重要,HMGB1參與這一過程部分是通過降低肺成纖維細胞增殖和下調肺泡灌洗液中的白介素1-p來實現。此外一些研究表明HMGB1可以增加血管內皮生長因子的分泌,而動物模型上,使用HMGB1抗體拮抗HMGB1活性可以抑制基質金屬蛋白酶-9活性；而這兩種因子在氣道重塑-這一支氣管哮喘重要病理生理過程中扮演重要作用�；谝陨腺Y料和實驗,我們假設釋放到氣道中HMGB1在慢性氣道小鼠模型的氣道重塑過程中扮演重要角色。為了驗證這個假設,我們檢測了HMGB1在小鼠肺組織和肺泡灌洗液中的含量,接下來我們通過檢測呼吸動力學、卵清白蛋白-特異性的Ig E,膠原沉積、氣道平滑肌厚度、上皮粘液分泌和炎癥介質變化觀察HMGB1對慢性哮喘小鼠模型氣道重塑的影響。此外我們在體外還觀察了HMGB1對人胎肺成纖維細胞的增殖、遷移和膠原合成是否有直接影響,以此闡明部分可能機制。最后我們還研究了HMGB1和HMGB1/IL-1β復合物對于轉化生長因子β1,血管內皮生長因子和基質金屬蛋白酶-9分泌表達影響,幫助明確這些因子的細胞來源。方法：一、動物實驗1.雌性Balb/c小鼠(每組8只)被隨機分成磷酸鹽(PBS)對照組,卵清蛋白蛋白組(OVA), OVA+同種異型抗體,OVA+抗HMGB1抗體組。小鼠通過OVA-氫氧化鋁凝膠腹腔注射致敏,繼而用OVA滴鼻反復激發(fā)6周制作慢性支氣管哮喘模型�？笻MGB1中和抗體在激發(fā)前使用。2.氣道高反應性在最后一次激發(fā)24小時進行,使用乙酰膽堿為激發(fā)劑,通過體積描記法和有創(chuàng)方法兩種方法測量氣道高反應性。3.肺泡灌洗液和肺組織的收集在最后一次激發(fā)后48小時處死小鼠,PBS灌洗后收集肺泡灌洗液。HE染色法分類計數肺泡灌洗液中細胞。酶聯免疫吸附測定法檢測肺泡灌洗液中細胞因子含量。右上肺凍存后用于測定膠原含量,右肺下葉用于做蛋白免疫印跡(WB)。左肺固定后石蠟包被后行HE染色、免疫組化、馬松三色染色、過碘酸-雪夫染色。4.膠原含量檢測根據膠原蛋白檢測試劑(Sirius Red Collagen Detection Kit)說明書檢測膠原含量,結果用膠原微克/克肺表示。5.免疫組化左肺固定后用HE染色評估肺組織病理改變,然后分別用a-SMA和HMGB1抗體檢測上述兩種蛋白在肺組織中的表達。二、體外細胞實驗1.HMGB1對人胎肺成纖維細胞MRC-5的體外影響人胎肺成纖維細胞MRC-5在培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)1.1成纖維細胞遷移實驗遷移實驗采用“畫痕實驗”進行比較1.2成纖維細胞增殖實驗以DMEM為培養(yǎng)基,在12孔板每孔種入5*104胎肺成纖維細胞,使用不同濃度的]HMGB1刺激MRC-5細胞1天,2天,3天后,分別用胰蛋白酶消化后計數每孔細胞數量。1.3采用熒光定量PCR和蛋白印記法分別檢測α-SMA的表達1.4成纖維細胞分泌膠原的檢測根據膠原檢測試劑盒說明書檢測HMGB1刺激MRC-5后其上清中膠原含量的變化。2.探討HMGB1和HMGB1/IL-1β復合物引起那些細胞的分泌表達轉化生長因子-β1,血管內皮生長因子,基質金屬蛋白酶-92.1原代培養(yǎng)人支氣管上皮細胞原代培養(yǎng)的支氣管上皮細胞種植于12孔板中,每孔2×105細胞,然后這些細胞接受HMGB1和HMGB1/IL-1β復合物刺激24小時。2.2細胞系的培養(yǎng)和分化細胞系A549,16-HBE, U937和THP-1均在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。1×106/毫升的THP-1和U937細胞分別接受佛波酯(PMA)刺激48小時和72小時,使得上述細胞分化成單核/巨噬細胞亞型。每次實驗時,2×105個上皮細胞和1×106個U937和THP-1細胞種植于12孔板中,分別接受HMGB1,IL-1β和]HMGB1/IL-1β復合物的刺激。上述細胞刺激24小時候,收集細胞上清、總RNA、細胞裂解液行進一步實驗檢測。2.3嗜酸性粒細胞的分離和培養(yǎng)采用負性免疫磁珠分離法分離外周血中嗜酸性粒細胞,采用HE染色檢測分離嗜酸性粒細胞純度,至少大于95%,分離成功后,嗜酸性粒細胞按照每孔5×105個細胞種植于24孔板中,然后接受HMGB1和HMGB1/IL-1β復合物刺激24小時。2.4中性粒細胞的分離和培養(yǎng)外周血的中性粒細胞的分離采用標準的Percoll梯度密度離心法。成功分離的中性粒細胞在37℃孵育箱中靜止1小時,然后接受]HMGB1和HMGB1/IL-1β復合物的刺激,未刺激的中性粒細胞作為對照組。2.5 HMGB1-IL-1β復合物的制備稀釋于PBS中的HMGB1按照預設的濃度比例分別與不同濃度的IL-1β混合后置于4℃冰箱中孵育16小時。2.6實時熒光定量PCR熒光定量PCR的定量采用目的基因的循環(huán)閾值(Ct值)與內參基因的循環(huán)閾值(Ct值)的比值比。2.7蛋白免疫印跡蛋白免疫印跡法檢測β-actin,β-Tubulin,VEGF, MMP-9,HMGB1和TGFβ1的蛋白表達含量變化,采用專業(yè)軟件Quantity One分析蛋白免疫印跡條帶。2.8酶聯免疫吸附測定法用酶聯免疫吸附測定法根據試劑盒說明書步驟檢測肺泡灌洗液、肺裂解液、細胞上清中OVA-特異性IgE, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IFN-γ,TNF-α,VEGF,總MMP-9和活性TGF-β1含量。統計學分析結果用平均數士標準誤表示,數據采用單因素方差分析或者兩分類方差分析分析,組間差異采用Bonferroni法比較,P值0.05被認為有統計學差異。結果1.HMGB1在慢性哮喘小鼠模型中表達上調OVA誘導的哮喘小鼠肺組織和肺泡灌洗液中]HMG1表達均升高,免疫組化提示HMGB1主要在小鼠肺泡巨噬細胞和上皮細胞表達,而HMGB1表達陽性細胞在該模型中顯著增加。2.拮抗HMGB1對OVA誘導的慢性哮喘小鼠模型氣道重塑影響與慢性哮喘組小鼠比較,拮抗HMGB1組的小鼠的肺泡總細胞數和嗜酸性粒細胞數明顯下降；OVA哮喘組的氣道高反應性明顯增加,而拮抗HMGB1活性后導致小鼠氣道高反應性的下降。與OVA誘導慢性哮喘組小鼠比較,接受抗HMGB1抗體注射組小鼠的氣道血管周圍區(qū)域的膠原沉積、PAS-陽性細胞數、氣道周圍平滑肌厚度均顯著下降。類似的,拮抗HMGB1均下降了小鼠外周血OVA-特異性IgE水平和肺泡灌洗液中的IL-1β, IL-4, IL-5, IL-13, TNF-α,VEGF,活性-TGF-β1和總MMP-9表達水平,免疫蛋白印記法進一步證明了：與慢性哮喘組小鼠比較,拮抗HMGB1組小鼠的肺組織的VEGF,總-TGF-β1和MMP-9的蛋白表達下降。另外,通過明膠酶譜法證實,與慢性哮喘組小鼠比較,拮抗HMGB1組小鼠的肺泡灌洗液中MMP-9的活性下降。3.體外HMGB1對MRC-5細胞影響濃度為250和1000ng/mlHMGB1能夠濃度依賴性的增加MRC-5細胞的遷移能力。另外濃度為250和1000ng/mlHMGB1能夠顯著增加MRC-5細胞的生長。以1000ng/mlHMGB1作時間依賴性實驗發(fā)現,這種促增殖效應在第2天最明顯。另外,濃度為250和1000ng/mlHMGB1能夠增加MRC-5細胞的α-SMA mRNA的表達和蛋白表達。而1000ng/mlHMGB1能夠提高該細胞膠原分泌2-3倍。4.HMGB1輕度增加TGF-β1的分泌HMGB1和IL-1β作用于嗜酸性粒細胞24小時,僅少量增加該細胞分泌TGF-β1,在其他細胞上沒有發(fā)現]HMGB1和IL-1β能夠增加TGF-β1的分泌。5.HMGB1增加MMP-9表達和活性0.5ng/mlIL-1β和250ng/mlHMGB1復合物以及2ng/mlIL-1β與1000ng/mlHMGB1復合物能夠顯著增加16-HBE細胞,PBECs, A549 cells和中性粒細胞的MMP-9細胞的分泌。6.HMGB1增加VEGF的表達和分泌HMGB1/IL-1β復合物可以增加16-HBE細胞,原代培養(yǎng)支氣管上皮細胞,A549細胞,未分化U937 cells,分化和未分化的THP-1細胞和肺泡巨噬細胞的VEGF的分泌和表達。結論抑制HMGB1可以抑制支氣管哮喘氣道重塑過程,這一效應可能與抑制氣道炎癥和調節(jié)肺成纖維細胞的激活和表型有關。
【關鍵詞】：支氣管哮喘 高遷移率族蛋白B1 氣道重塑 慢性氣道炎癥
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R562.25
【目錄】：

• 個人簡歷3-5
• 英文縮微詞中英文對照表5-6
• 摘要6-13
• abstract13-22
• 前言22-31
• 參考文獻27-31
• 第一部分 拮抗高遷移率族蛋白B1 (HMGB1)活性對慢性哮喘小鼠氣道重塑的影響31-86
• 1.材料和方法31-50
• 2.結果50-73
• 3.討論73-80
• 參考文獻80-86
• 第二部分 高遷移率組蛋白Bl(HMGBl)對人胚肺成纖維細胞(MRC-5)增殖、遷移、表型等影響86-103
• 1.材料和方法86-91
• 2.結果91-96
• 3.討論96-100
• 參考文獻100-103
• 第三部分 高遷移率組蛋白B1(HMGBl)對TGF-β1,MMP-9, VEGF表達和分泌影響103-123
• 1.材料和方法103-107
• 2.結果107-118
• 3.討論118-121
• 參考文獻121-123
• 全文小結123-125
• 綜述125-140
• 參考文獻133-140
• 致謝140-141
• 攻讀博士學位期間發(fā)表論文14

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