本文關(guān)鍵詞：Caspase-1在不可分型流感嗜血桿菌致呼吸道感染中的作用研究

  更多相關(guān)文章： 不可分型流感嗜血桿菌 A549 炎癥反應 固有免疫 Caspase-1

【摘要】：不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi)是流感嗜血桿菌中的無莢膜型,為機會致病菌,是小兒中耳炎和成人下呼吸道感染最重要的病原體。NTHi引起的下呼吸道感染與慢性阻塞性肺疾病(COPD)的急性發(fā)作密切相關(guān),主要與NTHi感染導致的機體固有免疫功能缺失、氣道屏障系統(tǒng)破壞和肺組織損傷有關(guān)。研究表明,NTHi感染引起的氣道炎癥反應主要是通過激活促炎癥因子IL-1β、CXCL-2和TNF-α的釋放,而這些前炎癥因子的高表達是通過Toll樣受體(TLRs)激活MAPK和NF-κB這兩條細胞信號傳導通路來完成的。近期研究表明NOD樣受體(NLRs)信號通路是固有免疫應答的重要組成部分,其在抵御病原體感染的過程中發(fā)揮了重要作用。NLRs蛋白3,NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrin domain3)炎性小體能夠活化Caspase-1進而產(chǎn)生并釋放成熟的促炎因子白細胞介素1β和白細胞介素18,參與體內(nèi)炎癥反應。Caspase-1是NLRP3炎癥復合體中的一種重要蛋白,NLRP3炎癥復合體誘導組裝后會激活Caspase-1,剪切pro-IL-1β和pro-IL-18轉(zhuǎn)化成有成熟的IL-1β和IL-18,從而引發(fā)前炎性反應和抗菌反應。有研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體和Caspase-1的激活與李斯特菌和金黃色葡萄球菌感染引起的先天性免疫應答密切相關(guān),而其與NTHi在呼吸道感染中的關(guān)系卻鮮見報道。為完成此研究,本實驗首先選用不同濃度的NTHi感染人肺泡上皮細胞株(A549)建立呼吸道感染體外模型,進而研究NTHi對A549的存活及凋亡的影響并以分子生物學手段分析NLRP3炎性小體、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達情況,以及檢測A549中的炎癥因子IL-6和TNF-α在中的含量。我們又以NTHi感染小鼠,建立呼吸道感染體內(nèi)模型,并應用HE染色和免疫組化等方法檢測氣道組織損傷和Caspase-1表達情況,同時RT-PCR檢測肺組織中Caspase-1、NF-κB和IL-1β的m RNA水平。體外實驗結(jié)果表明,1、NTHi在培養(yǎng)9~13h后進入對數(shù)生長期,得出細菌對數(shù)生長期方程為:Y=0.586x+8.015(R=0.985);2、不同濃度的NTHi感染降低細胞存活率,并增加凋亡和壞死的細胞數(shù)量,同時上調(diào)炎癥細胞因子IL-6和TNF-α的表達;3、不同濃度的NTHi感染A549導致IL-1β和IL-18的表達水平隨著細菌濃度的增高而增高,而當NTHi濃度達到1×108 CFU/m L時,Caspase-1的表達開始出現(xiàn)減少,同時IL-1β和IL-18的表達繼續(xù)增加。體內(nèi)實驗結(jié)果表明:1、NTHi感染能導致小鼠肺泡間隔斷裂,炎癥細胞浸潤,組織損傷程度與細菌濃度相關(guān);2、NTHi感染上調(diào)小鼠氣道組織中Caspase-1的表達,同時上調(diào)NF-κB和IL-1βm RNA。結(jié)論:1、NTHi感染可能會通過上調(diào)固有免疫中炎性小體的重要組分——Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達,促進細胞炎癥的產(chǎn)生,降低A549細胞存活率并誘導細胞凋亡和死亡。2、NTHi可能通過NF-κB途徑上調(diào)固有免疫分子Caspase-1的表達致BALB/c小鼠出現(xiàn)呼吸道黏膜損傷,引發(fā)下呼吸道感染。
【關(guān)鍵詞】：不可分型流感嗜血桿菌 A549 炎癥反應 固有免疫 Caspase-1
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R56
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 中英文對照表12-14
• 第一章 緒論14-19
• 1.1 不可分型流感嗜血桿菌與呼吸道疾病的關(guān)系14-15
• 1.2 固有免疫15-17
• 1.3 不可分型流感嗜血桿菌與固有免疫的研究現(xiàn)況17-19
• 第二章 體外實驗研究19-38
• 2.1 實驗材料19
• 2.1.1 實驗用細胞株19
• 2.1.2 實驗用細菌菌株19
• 2.2 實驗試劑與儀器19-21
• 2.2.1 主要試劑19-21
• 2.2.2 主要儀器與設(shè)備21
• 2.3 主要試劑配制21-23
• 2.3.1 巧克力瓊脂培養(yǎng)基的配制21-22
• 2.3.2 細菌凍存液22
• 2.3.3 NTHi增菌液22
• 2.3.4 細胞凍存液22
• 2.3.5 0.4%臺盼藍染液22
• 2.3.6 Western Blot實驗材料22-23
• 2.3.7 ELISA實驗材料23
• 2.4 實驗方法23-28
• 2.4.1 NTHi的分離培養(yǎng)及其生長曲線的繪制23-24
• 2.4.2 A549細胞的培養(yǎng)24
• 2.4.3 NTHi感染A549細胞模型的建立24
• 2.4.4 不同濃度NTHi對細胞活力和凋亡的影響24-25
• 2.4.5 WB檢測NTHi標準株和臨床株感染的A549細胞產(chǎn)生的Caspase-1，IL-1β 和IL-18蛋白表達水平25-27
• 2.4.6 ELISA法檢測NTHi標準株和臨床株作用后細胞因子TNF-α 和IL-6 的蛋白表達水平27
• 2.4.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析27-28
• 2.5 實驗結(jié)果28-36
• 2.5.1 NTHi分離培養(yǎng)及細菌生化反應和革蘭染色形態(tài)鑒定28-29
• 2.5.2 NTHi生長曲線的繪制29
• 2.5.3 NTHi在對數(shù)生長期活菌數(shù)與OD600值的函數(shù)關(guān)系29-30
• 2.5.4 NTHi抑制A549細胞存活率30-31
• 2.5.5 NTHi誘導A549細胞凋亡31-32
• 2.5.6 NTHi感染促進A549細胞表達炎癥蛋白Caspase-1，IL1β和IL-1832-34
• 2.5.7 NTHi感染促進A549細胞分泌炎性細胞因子TNF-α 和IL-634-36
• 2.6 討論36-38
• 第三章 體內(nèi)研究38-51
• 3.1 實驗材料38-39
• 3.1.1 實驗動物38
• 3.1.2 實驗試劑38-39
• 3.1.3 實驗儀器39
• 3.2 實驗方法39-43
• 3.2.1 NTHi引起的呼吸道感染動物模型的建立39-40
• 3.2.2 小鼠肺組織和氣管HE染色40
• 3.2.3 小鼠的氣管和肺組織免疫組織化學染色40-41
• 3.2.4 RT-PCR檢測小鼠肺組織Caspase-1、NF- κB和IL-1βm RNA表達41-43
• 3.2.5 統(tǒng)計學分析43
• 3.3 實驗結(jié)果43-49
• 3.3.1 小鼠呼吸道感染NTHi43-44
• 3.3.2 NTHi感染損傷小鼠氣管和肺組織44-46
• 3.3.3 NTHi感染上調(diào)小鼠氣管和肺組織中Caspase-1 的表達46-48
• 3.3.4 NTHi上調(diào)小鼠肺組織中Caspase-1，NF-κB和IL-1βm RNA水平48-49
• 3.4 討論49-51
• 第四章 結(jié)論51-52
• 參考文獻52-59
• 攻讀碩士期間所取得的科研成果59-60
• 致謝60

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