本文關(guān)鍵詞：VEGF-A，C，D作為惡性漿膜腔積液診斷、預(yù)后及療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物的研究

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【摘要】：肺癌、乳腺癌和惡性淋巴瘤是導(dǎo)致惡性胸腔積液的前３位病因，一旦出現(xiàn)了惡性胸腔積液，患者平均生存期往往不到6個(gè)月。惡性腹腔積液最常見(jiàn)于消化道腫瘤和婦科腫瘤，一旦腫瘤患者出現(xiàn)了惡性腹腔積液，即預(yù)示中位生存期不足20周，尤其以消化道腫瘤引起的惡性腹腔積液預(yù)后最差，生存期僅12-20周。心包積液一般為患者臨終前表現(xiàn)，預(yù)后更差。惡性漿膜腔積液的治療常常是臨床上的一個(gè)難題和挑戰(zhàn)。目前惡性漿膜腔積液的常規(guī)治療主要是利尿、限鹽、漿膜腔穿刺抽液術(shù)、腔內(nèi)化療，生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，中藥，熱療等，但療效均不理想，治療后腔內(nèi)積液往往減少不明顯、復(fù)發(fā)較快，同時(shí)幾乎所有治療都有不同程度的毒副反應(yīng)。研究表明：腫瘤浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移至胸腹膜后，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF（Vascularendothelial growth factor)水平的升高、腫瘤新生血管的生成以及血管通透性增加是漿膜腔內(nèi)積液形成的重要機(jī)制。VEGF家族包括6種類型:VEGF-A、B、C、D、E和胎盤生長(zhǎng)因子PIGF（placental growth factor），主要由腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，VEGF-A是腫瘤血管生成中最重要的調(diào)控因子，VEGF-C和VEGF-D是腫瘤淋巴管生成中最重要的調(diào)控因子。應(yīng)用血管生成抑制劑，特別是靶向VEGF的藥物，已經(jīng)成為基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)漿膜腔積液中VEGF的研究主要集中于代表血管生成的VEGF-A研究，代表淋巴管生成的VEGF-C，VEGF-D研究甚少。國(guó)產(chǎn)一類創(chuàng)新藥物重組人血管內(nèi)皮抑素(rh-endostatin，商品名endostar，恩度)是一種人源化廣譜的抗血管生成藥物，可以下調(diào)多種促血管生成因子對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用，直接作用靶點(diǎn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮直接和間接抗血管作用。近年來(lái)，有多位學(xué)者探索應(yīng)用恩度單藥或者聯(lián)合化療藥物治療惡性漿膜腔積液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種方法高效低毒，控制積液作用強(qiáng)，耐受性高，并能明顯地改善患者的生活質(zhì)量。但是恩度等血管生成抑制劑的療效評(píng)價(jià)體系、探索針對(duì)性的分子標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)恩度的療效，還有大量的工作需要人們?nèi)プ�。如何完善并利用分子�?biāo)記物來(lái)指導(dǎo)惡性漿膜腔積液的臨床診斷、預(yù)后、預(yù)測(cè)其療效、優(yōu)化其治療是未來(lái)工作的方向。本研究通過(guò)檢測(cè)原發(fā)于肺癌及胃癌的惡性漿膜腔積液上清及細(xì)胞水平的VEGF-A,C,D的蛋白含量及表達(dá)，探究三因子在惡性漿膜腔積液診斷，預(yù)后及恩度療效預(yù)測(cè)的臨床價(jià)值。并建立了穩(wěn)定整合熒光素酶（luciferase）的胃癌未分化NUGC-4-luc細(xì)胞系，并以該細(xì)胞系為基礎(chǔ)，建立胃癌裸鼠腹水瘤模型，結(jié)合生物發(fā)光活體成像（in vivo bioluminescent imaging system）動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腹水癌細(xì)胞的變化，并檢測(cè)腹膜結(jié)節(jié)微血管密度MVD（microvesseldensity）、淋巴管密度LVD (1ymphatic vessel density)的數(shù)量，綜合評(píng)價(jià)分子標(biāo)志物VEGF-A,C,D在惡性漿膜腔積液靶向治療中的價(jià)值。 第一部分VEGF-A,C,D在惡性漿膜腔積液中診斷及預(yù)后的臨床意義 目的：評(píng)價(jià)VEGF-A,C,D在惡性漿膜腔積液中診斷，預(yù)后的臨床價(jià)值，尋找合適的檢測(cè)水平，為局部抗血管抗淋巴管治療提供依據(jù)。 方法：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISAenzyme-linked immunosorbentassay）方法檢測(cè)漿膜腔積液患者外周血清79例（肺癌30例，胃癌21例，良性積液28例），積液上清96例（肺癌38例，胃癌30例，良性積液28例） VEGF-A,C,D的蛋白含量；免疫細(xì)胞化學(xué)方法（ICCimmunocytochemistry）檢測(cè)積液細(xì)胞水平71例（肺癌34例，胃癌17例，良性積液20例）VEGF-A,C,D的蛋白表達(dá)，通過(guò)SPSS17.0分析其診斷，預(yù)后，臨床病理因素及其相關(guān)性的臨床意義。 結(jié)果： 1VEGF-A 1.1VEGF-A含量及表達(dá)：血清sVEGF-A含量在癌組及良性組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p0.05)。積液上清pVEGF-A含量在肺癌及胃癌組均高于良性積液組(p0.05)，且pVEGF-A的升高在肺癌組和胃癌組間無(wú)差別(p0.05)。pVEGF-A與sVEGF-A含量在良性積液組相近，但在惡性積液中顯示pVEGF-A明顯高于sVEGF-A水平(p0.05)。20例良性積液未見(jiàn)癌細(xì)胞，染色部位主要位于間皮細(xì)胞胞漿，淋巴細(xì)胞及粒細(xì)胞均未著色。細(xì)胞水平（cVEGF-A）在51例惡性積液患者中表達(dá)率為52.94%，均主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞漿。 1.2VEGF-A與臨床病理因素聯(lián)系：pVEGF-A與年齡呈負(fù)相關(guān)，與惡性積液，血性積液及單發(fā)胸腹膜轉(zhuǎn)移成正相關(guān)(p0.05)。cVEGF-A與年齡呈負(fù)相關(guān)，回歸系數(shù)B為0.340(p0.05)。 1.3血清sVEGF-A，積液上清pVEGF-A與生存關(guān)系：以惡性積液患者血清及上清三指標(biāo)含量的中位值為臨界值，分為高含量及低含量組，對(duì)比其1年生存率情況。 pVEGF-A水平406.19pg/ml較pVEGF-A≤406.19pg/ml患者1年生存期短，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異處于邊緣值(p=0.066)。sVEGF-A水平未顯示1年生存差別(p0.05)。 2VEGF-C, VEGF-D 2.1VEGF-C，VEGF-D的含量及表達(dá)：血清sVEGF-C，sVEGF-D含量在癌組及良性組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p0.05)。積液上清pVEGF-C，pVEGF-D含量在癌組及良性組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p0.05)。細(xì)胞水平cVEGF-C，cVEGF-D在51例惡性患者中表達(dá)率分別為70.58%和82.35%，均主要表達(dá)與癌細(xì)胞的胞漿。cVEGF-D在肺癌及胃癌惡性漿膜腔積液中的陽(yáng)性表達(dá)，尤其是強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)明顯高于cVEGF-A，cVEGF-C (p0.05)。cVEGF-A,C,D在惡性漿膜腔積液中肺癌組與胃癌組無(wú)病種差別(p0.05)。 2.2VEGF-C, VEGF-D與臨床病理因素聯(lián)系：pVEGF-C與年齡呈負(fù)相關(guān)(p0.05)。pVEGF-D與年齡正相關(guān)，與惡性積液及單發(fā)漿膜轉(zhuǎn)移成負(fù)相關(guān)(p0.05)。sVEGF-C，sVEGF-D蛋白水平與臨床病理因素?zé)o相關(guān)。cVEGF-C，cVEGF-D蛋白表達(dá)與臨床病理因素?zé)o相關(guān)。 2.3血清sVEGF-C，sVEGF-D，積液上清pVEGF-C，pVEGF-D與生存關(guān)系：上清pVEGF-C，pVEGF-D,及血清sVEGF-C，sVEGF-D水平均未顯示1年生存差別(p0.05)。 結(jié)論： 1積液上清VEGF-A在良惡性積液有差異，提示可能成為良惡性積液的腫瘤標(biāo)志物。上清VEGF-A在1年生存預(yù)后中達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)邊緣值，需引起重視，需擴(kuò)大樣本量及延長(zhǎng)隨訪時(shí)間進(jìn)一步探討其預(yù)后價(jià)值。 2積液上清及細(xì)胞水平VEGF-A與年齡呈負(fù)相關(guān)，提示隨年齡增長(zhǎng)，VEGF-A水平下降；積液上清VEGF-A在惡性、血性積液及單發(fā)漿膜轉(zhuǎn)移中，含量高于良性、非血性及非單發(fā)漿膜轉(zhuǎn)移患者。 3積液上清VEGF-C，VEGF-D在良惡性診斷方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在癌細(xì)胞水平卻高表達(dá)。臨床需擴(kuò)大良性積液樣本，進(jìn)行病種分層后進(jìn)一步研究其積液上清的診斷價(jià)值。 4血清VEGF-A,C,D水平在漿膜腔積液診斷及預(yù)后中均無(wú)明顯臨床意義，亦與臨床病理因素?zé)o明顯關(guān)聯(lián)。提示血清學(xué)標(biāo)志物在漿膜腔積液的診斷預(yù)后價(jià)值可能不及局部標(biāo)志物。 第二部分VEGF-A,C,D在恩度治療惡性漿膜腔積液中療效預(yù)測(cè)的臨床意義 目的：評(píng)價(jià)VEGF-A,C,D在恩度治療惡性漿膜腔積液中的療效預(yù)測(cè)價(jià)值。 方法：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）方法檢測(cè)，20對(duì)惡性漿膜腔積液患者恩度腔內(nèi)治療前后，積液上清VEGF-A,C,D蛋白含量，通過(guò)SPSS17.0分析以上三因子在恩度療效預(yù)測(cè)中的價(jià)值。 結(jié)果： 1局部漿膜腔單藥恩度組，局部漿膜腔恩度聯(lián)合順鉑組及局部恩度聯(lián)合全身抗腫瘤治療組，在客觀有效率RR(CR+PR)，臨床獲益率DCR(CR+PR+SD)及局部進(jìn)展PD方面均未見(jiàn)明顯差異，（p0.05）。 2積液上清VEGF-A,C,D蛋白含量與療效的關(guān)系：以療效評(píng)價(jià)指標(biāo)RR，SD，PD進(jìn)行分組：三因子治療前后變化差值（d0-d7）及治療前后變化差值比（d0-d7/d0），在RR，SD，PD組間均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，p0.05，其中上清VEGF-A差值比（d0-d7/d0）組間p=0.085。 3積液上清VEGF-A,C,D蛋白含量在治療組間的差別：積液上清VEGF-A,C,D的治療前后變化差值比（d0-d7/d0）在三治療組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05）。 結(jié)論： 1積液上清VEGF-A,C,D的治療前后變化差值（d0-d7）及治療前后變化差值比（d0-d7/d0）在RR, NC, PD組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，提示以上三因子尚不能預(yù)測(cè)局部恩度療效。 2積液上清VEGF-A,C,D治療前后變化差值比（d0-d7/d0）在恩度不同治療組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，提示以上三因子尚不能指導(dǎo)臨床選擇不同的藥物治療方式。 第三部分VEGF-A,C,D在恩度不同給藥方式治療胃癌腹水瘤模型中的研究 目的：結(jié)合癌細(xì)胞監(jiān)測(cè)及血管、淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記，綜合評(píng)價(jià)分子標(biāo)志物VEGF-A,C,D在胃癌腹水瘤模型中的價(jià)值；探討恩度順鉑不同給藥方式的療效。 方法：培養(yǎng)NUGC-4-luc細(xì)胞（RPMI1640培養(yǎng)基+10%FBS+1%P/S），取5x106數(shù)量級(jí)細(xì)胞在0.5ml PBS中，腹腔接種28只雌性裸鼠，接種后每周行動(dòng)物生物發(fā)光活體成像。接種一周后隨機(jī)分組：Group1:順鉑(1mg/kg)d1-3+恩度(8mg/kg)d4-7；Group2:恩度(8mg/kg) d1-4+順鉑(1mg/kg)d5-7；Group3:恩度(8mg/kg)+順鉑(1mg/kg)d1,4,7；Group4即對(duì)照組：生理鹽水50ul d1-7，均腹腔給藥，連用2周（每周成像一次），停藥觀察一周成像后處死。處死后取腹水上清，應(yīng)用ELISA方法，檢測(cè)積液上清VEGF-A,C,D蛋白含量；腹膜結(jié)節(jié)包被蠟塊后，HE確認(rèn)癌細(xì)胞，應(yīng)用IHC方法，檢測(cè)VEGF-A,C,D及MVD，LVD。動(dòng)物發(fā)光數(shù)據(jù)先經(jīng)IVIS系統(tǒng)處理，后通過(guò)SPSS17.0，分析其活體成像，VEGF-A,C,D蛋白表達(dá)及含量，LVD，MVD數(shù)量在四個(gè)治療組間的差別。 結(jié)果： 1成瘤情況 5×106數(shù)量級(jí)NUGC-4-luc細(xì)胞接種于裸鼠腹腔。7天后，據(jù)測(cè)量的癌細(xì)胞光子數(shù)進(jìn)行分組，四組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05）。Group2中1只動(dòng)物在用藥后第18天意外死亡。裸鼠用藥后隔日測(cè)量四組小鼠的體重并記錄，繪制小鼠體重變化曲線，4組無(wú)明顯區(qū)別（p0.05）。裸鼠處死后顯示血性腹水明顯，腹膜細(xì)小結(jié)節(jié)多而廣泛。 2用藥療效 2.1四組腹水量(ml)：Group4（4.87±0.45）Group1（3.1±0.53）Group2（2.0±0.08）Group3（1.8±0.16）。 2.2四組腹膜結(jié)節(jié)數(shù)量：Group4（33.75±2.5） Group2（21.66±5.77） Group3（18.75±2.5） Group1（8.75±4.78）。 2.3癌細(xì)胞光子數(shù) 據(jù)每次測(cè)量的癌細(xì)胞光子數(shù)繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后顯示，在第1天及第8天四治療組無(wú)明顯區(qū)別，p0.05。第15天及21天時(shí)顯示，Group1, Group2, Group3均優(yōu)于Group4，p0.01。其中第15天時(shí)（用藥后2周），恩度聯(lián)合順鉑組（Group3）及順鉑序貫恩度組（Group1）均優(yōu)于恩度序貫順鉑組（Group2），p0.05；但Group3與Group1無(wú)明顯區(qū)別，p0.05。第21天時(shí)（用藥后2周，觀察1周），Group3仍優(yōu)于Group2，p0.05。 2.4腹膜結(jié)節(jié)MVD,LVD數(shù)量 D2-40和CD34以染成棕黑色管腔的判定為淋巴管及血管。MVD在四組間有差異（p0.01），經(jīng)過(guò)兩兩比較，MVD數(shù)量Group4Group1 Group2（p0.01），Group2與Group3無(wú)差別（p0.05）。而LVD數(shù)量在四組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（p0.05）。 3VEGF-A,C,D的蛋白含量及表達(dá) 3.1腹水上清VEGF-A,C,D的蛋白含量：上清VEGF-A在四組有差別（p0.05）；經(jīng)過(guò)兩兩比較，四組均有差別（p0.05），VEGF-A蛋白含量在Group4 Group1 Group2 Group3。而腹水上清VEGF-C, VEGF-D的蛋白含量在四組間無(wú)明顯差別（p0.05）。 3.2腹膜結(jié)節(jié)VEGF-A,C,D蛋白表達(dá)：VEGF-A,C,D均在癌細(xì)胞胞漿著色，統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)VEGF-A在四組表達(dá)有差別（p0.05），兩兩比較，Group4Group2Group1（p0.05），Group1與Group3無(wú)區(qū)別（p0.05）。而腹膜結(jié)節(jié)VEGF-C, VEGF-D的蛋白表達(dá)在四組間無(wú)明顯差別（p0.05）。 4VEGF-A蛋白含量與腹水量高度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.994（p0.01）。VEGF-A蛋白表達(dá)與腹膜結(jié)節(jié)數(shù)量高度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.972（p0.01）；與MVD及癌細(xì)胞光子數(shù)均無(wú)相關(guān)關(guān)系（p0.05）。 結(jié)論： 1本研究首次建立了穩(wěn)定整合luciferase的胃癌未分化NUGC-4-luc細(xì)胞系，并建立了以該細(xì)胞系為基礎(chǔ)的胃癌裸鼠腹水瘤模型，為利用生物發(fā)光活體成像技術(shù)，研究胃癌腹膜轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移機(jī)制及抗癌藥物的研發(fā)，提供了穩(wěn)定可靠、直觀、方便、靈敏的動(dòng)物模型。 2本研究中恩度聯(lián)合順鉑及序貫組均耐受性好，治療應(yīng)至少2周后差別顯著。首次結(jié)合活體成像及MVD，提示恩度聯(lián)合順鉑優(yōu)于序貫，聯(lián)合組對(duì)癌細(xì)胞的殺傷及對(duì)血管內(nèi)皮的抑制作用均最大；順鉑序貫恩度殺傷癌細(xì)胞優(yōu)于恩度序貫順鉑；恩度序貫順鉑對(duì)腹膜血管內(nèi)皮的抑制優(yōu)于順鉑序貫恩度，，故提示可以通過(guò)分子標(biāo)志物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)變化及功能成像監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞數(shù)量，共同指導(dǎo)臨床合理選擇靶向及細(xì)胞毒藥物的用藥時(shí)機(jī)。 3VEGF-A與腹水量及腹膜結(jié)節(jié)數(shù)量正相關(guān)，提示VEGF-A不僅可以預(yù)測(cè)腹水量還可以預(yù)測(cè)腹膜結(jié)節(jié)的變化，突破了臨床只依據(jù)腹水量判斷療效的局限性。VEGF-A與癌細(xì)胞光子數(shù)及MVD無(wú)相關(guān)關(guān)系，提示VEGF-A優(yōu)化治療作用局限。 4未發(fā)現(xiàn)腹水及腹膜結(jié)節(jié)VEGF-C，VEGF-D，LVD在四治療組間差別，尚不能提示其療效預(yù)測(cè)作用。
【關(guān)鍵詞】：惡性漿膜腔積液 VEGF 診斷 預(yù)后 預(yù)測(cè)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R561.3
【目錄】：

• 摘要5-12
• ABSTRACT12-22
• 英文縮寫22-24
• 引言24-26
• 第一部分 VEGF-A，C，D 在惡性漿膜腔積液中診斷及預(yù)后的臨床意義26-45
• 前言26-27
• 材料與方法27-31
• 結(jié)果31-33
• 附圖33-36
• 附表36-39
• 討論39-41
• 小結(jié)41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 第二部分 VEGF-A，C，D 在恩度治療惡性漿膜腔積液中療效預(yù)測(cè)的臨床意義45-57
• 前言45
• 材料與方法45-49
• 結(jié)果49-50
• 附表50-52
• 討論52-53
• 小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 第三部分 VEGF-A，C，D 在恩度不同給藥方式治療胃癌腹水瘤模型中的研究57-81
• 前言57
• 材料與方法57-66
• 結(jié)果66-69
• 附圖69-73
• 附表73-74
• 討論74-77
• 小結(jié)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-81
• 結(jié)論81-82
• 綜述一 VEGF 家族因子在惡性漿膜腔積液診療中研究進(jìn)展82-98
• 參考文獻(xiàn)91-98
• 綜述二 恩度治療惡性漿膜腔積液的研究進(jìn)展98-107
• 參考文獻(xiàn)104-107
• 致謝107-109
• 個(gè)人情況109

【引證文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 莊克川;華蟾素注射液腔內(nèi)灌注治療惡性漿膜腔積液的回顧性研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

本文編號(hào)：615772