本文關鍵詞：人羊膜勻漿上清液對脂多糖致肺微血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

  更多相關文章： 人羊膜勻漿上清液 肺微血管內(nèi)皮細胞 細胞培養(yǎng) 脂多糖 細胞因子

【摘要】：研究目的(1)觀察不同濃度的人羊膜勻漿上清液(human Amniotic Homogenates Supernatant, hAHS)對體外培養(yǎng)的SD大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(Pulmonary Microvascular Endothelial Cells, PMVEC)增殖的影響。(2)探討hAHS對脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)致SD大鼠PMVEC損傷后細胞增殖及PMVEC促炎細胞因子表達的影響。研究方法(1) hAHS的制備及其總蛋白與相關因子含量的測定：取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦胎膜,PBS沖洗,于無菌條件下剝離人羊膜,同時鑒定其活力。將活力大于95%的人羊膜剪碎后放入EP管,按體積比1：1加入DMEM/F12勻漿,轉(zhuǎn)移勻漿液并按體積比1：5加入DMEM/F12后離心,離心后取上清液用細菌過濾器過濾,收集濾液,即得到用于細胞培養(yǎng)的hAHS,-80℃凍存?zhèn)溆�。參照上述方�?將過程中的DMEM/F12用PBS替代,制得用于細胞因子檢測的hAHS,并用考馬斯亮藍法檢測其總蛋白含量,ELISA法檢測細胞因子EGF、bFGF、 VEGF、IL-4、IL-10、Ang-1、HBD2的含量。(2)觀察不同濃度hAHS對體外培養(yǎng)的大鼠PMVEC增殖的影響：將第一代PMVEC培養(yǎng)至第6天后消化并以1×104cell/mL密度接種于96孔板,每孔200μL。孵育24h后棄培養(yǎng)液,按分組更換培養(yǎng)基,并隔天換液。根據(jù)培養(yǎng)基配方不同而分為五組(各配方中FBS、 hAHS、DMEM/F12的濃度均指其占培養(yǎng)基總體積的百分數(shù))：0%hAHS組為10%FBS+90% DMEM/F12,10%hAHS組為10%FBS+80%DMEM/F12+10%hAHS,15%hAHS組為10%FBS+75% DMEM/F12+15%hAHS,20%hAHS組為10%FBS+70% DMEM/F12 +20%hAHS,25%hAHS組為10%FBS+65%DMEM/F12+25%hAHS。分別于每組第一次更換培養(yǎng)基后的第0(當天)、1、3、5、7、9、11天用MTT法檢測各孔的OD值、繪制生長曲線、計算各組細胞增殖率。(3) hAHS對LPS致PMVEC損傷的保護作用：培養(yǎng)第一代PMVEC至融合度為80%時消化,以4×104cell/mL密度接種于96孔板,每孔200μL。孵育24h后,用含10%FBS的DMEM/F12換液,培養(yǎng)至第2天后,按分組更換培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基中FBS、LPS及hAHS配比不同分為四組(各組培養(yǎng)基中FBS、hAHS、DMEM/F12的濃度均指其占培養(yǎng)基總體積的百分數(shù),LPS濃度均指培養(yǎng)基中LPS的終濃度)：N組10%FBS+90%DMEM/F12, A組10%FBS+75%DMEM/F12+15%hAHS,B組10%FBS+90%DMEM/F12+20μg/mL LPS,C組10%FBS+75%DMEM/F12+15%hAHS+20μg/mL LPS。按照實驗分組更換培養(yǎng)基后的第0(當天)、12、24、48、72h用MTT法檢測細胞OD值,第6、8、10、12、24h收集細胞培養(yǎng)上清液,采用ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中鼠源性IL-6、IL-8、TNF-α含量。研究結果(1) hAHS中總蛋白含量為(725.125±12.625)mg/L,其中部分細胞因子含量分別為：EGF (504.785±4.665)ng/L、bFGF(4.426±0.138)ng/L、VEGF(0.185±0.006)ng/L,IL-4 (25.650±4.104)ng/L、IL-10(13.733±2.197)ng/L、Ang-1 (15.561±0.496)ng/L、HBD2 (4.763±0.714)ng/L。(2) hAHS促進PMVEC增殖實驗中,各組生長曲線趨勢為——0%hAHS組,細胞從第0至3天為停滯期,第3天開始緩慢增長,第4天開始進入對數(shù)生長期,第7天到達平臺期并持續(xù)至第10天,繼而進入衰亡期；10%hAHS組,前4天與0%hAHS組相似,第4至8天為對數(shù)生長期,第8至10天為平臺期,繼而進入衰亡期；15%hAHS組,前4天與0%hAHS組相似,第4至7天為對數(shù)生長期,第7至9天為平臺期,繼而進入衰亡期；20%hAHS組,與0%hAHS組類似；25%hAHS組,與15%hAHS組類似。各組OD值、增殖率相比——10%hAHS組OD值在第1、3、5天大于0%hAHS組但無統(tǒng)計學差異(P0.05),在第7、9、11天大于0%hAHS組且有統(tǒng)計學差異(P0.05)；增殖率在第7天大于0%hAHS且有統(tǒng)計學差異(P0.05),其他時間點無統(tǒng)計學差異(P0.05)。15%hAHS組OD值在第1、3天大于0%hAHS組但無統(tǒng)計學差異(P0.05),在第5、7、9、11天大于0%hAHS組且有統(tǒng)計學差異(P0.05)；增殖率在第5、7天大于0%hAHS且有統(tǒng)計學差異(P0.05),其他時間點無統(tǒng)計學差異(P0.05)。20%hAHS組OD值在各時間點與0%hAHS組相比均無統(tǒng)計學差異(P0.05),增殖率在第9天小于0%hAHS且有統(tǒng)計學差異(P0.05),其他時間點無統(tǒng)計學差異(P0.05)。25%hAHS組OD值在第1、3、5與0%hAHS組相比無統(tǒng)計學差異(P0.05),在第7、9、11天小于0%hAHS組且有統(tǒng)計學差異(P0.05)；增殖率在第7、9、11天小于0%hAHS且有統(tǒng)計學差異(P0.05),其他時間點無統(tǒng)計學差異(P0.05)。(3) hAHS對LPS致傷PMVEC的保護實驗中：A組(hAHS組)在第48、72h的OD值高于對照N組,有統(tǒng)計學差異(P0.05)；IL-6、IL-8、TNF-α的含量在各時間點與N組(FBS組)相比無統(tǒng)計學差異(P0.05)。B組(LPS致傷組)在第24、48、72h的OD值低于對照N組,具有統(tǒng)計學差異(P0.05)；IL-6、IL-8(6h除外)、TNF-a的含量在各時間點均高于對照N組,且具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。C組(LPS+hAHS保護組)在第24、48、72h的OD值高于實驗B組,具有統(tǒng)計學差異(P0.05)；IL-6的含量在10、12h時低于實驗B組,IL-8的含量在8、10、12、24h時低于實驗B組,TNF-a的含量在各時間點低于實驗B組,且具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。研究結論(1) hAHS含有豐富的細胞因子,如EGF、bFGF、VEGF、IL-4、IL-10、HBD2、Ang-1。(2) hAHS在10、15%濃度時對體外培養(yǎng)的SD大鼠PMVEC增殖有促進作用,尤其在15%濃度時促進作用最明顯。但在25%時出現(xiàn)抑制PMVEC增殖的現(xiàn)象。(3) hAHS對LPS致SD大鼠PMVEC損傷后細胞增殖具有保護作用,并可降低LPS誘導PMVEC后細胞分泌促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α的表達。
【關鍵詞】：人羊膜勻漿上清液 肺微血管內(nèi)皮細胞 細胞培養(yǎng) 脂多糖 細胞因子
【學位授予單位】：廣西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-22
• 1.1 肺微血管內(nèi)皮細胞與急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征12-15
• 1.1.1 肺微血管內(nèi)皮細胞生物學特性13
• 1.1.2 肺微血管內(nèi)皮細胞的分泌功能13-14
• 1.1.3 肺微血管內(nèi)皮細胞與炎癥反應14-15
• 1.1.4 肺微血管內(nèi)皮細胞與血管通透性15
• 1.2 急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征治療進展15-19
• 1.2.1 藥物治療15-17
• 1.2.2 機械通氣與體外膜肺氧合治療17-18
• 1.2.3 基因治療18
• 1.2.4 干細胞治療18-19
• 1.3 人羊膜干細胞及人羊膜源性細胞因子在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征防治中的應用19-21
• 1.3.1 人羊膜生物學特性19-20
• 1.3.2 人羊膜在肺損傷中的應用20-21
• 1.4 小結21-22
• 第2章 材料與方法22-28
• 2.1 實驗器材22-23
• 2.2 實驗試劑23-24
• 2.3 SD大鼠PMVEC的購買、傳代與凍存24
• 2.4 hAHS的制備24-25
• 2.5 hAHS中總蛋白與相關因子含量的測定25
• 2.6 不同濃度hAHS對SD大鼠PMVEC增殖的影響25-26
• 2.7 hAHS對LPS致SD大鼠PMVEC損傷的保護作用26-27
• 2.8 統(tǒng)計學處理27-28
• 第3章 實驗結果28-34
• 3.1 hAHS的總蛋白與相關因子的含量28
• 3.2 不同濃度hAHS對SD大鼠PMVEC增殖的影響28-30
• 3.3 不同濃度hAHS對SD大鼠PMVEC增殖率的影響30-31
• 3.4 hAHS對LPS致SD大鼠PMVEC損傷后細胞增殖的影響31-32
• 3.5 細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8、TNF-α含量32-34
• 第4章 討論34-36
• 第5章 結論與展望36-37
• 參考文獻37-44
• 附錄44-48
• 1. 英文縮寫一覽表44-46
• 2. 全文附圖46-48
• 攻讀碩士期間發(fā)表的與學位論文有關的論文目錄48-49
• 致謝49-50

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本文編號：614972