本文關(guān)鍵詞：連環(huán)素p120在香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)中的作用及其分子機制

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【摘要】：第一部分p120活化NF-κB信號通路在香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用 一、目的 通過香煙煙霧提取物(CSE)刺激人氣道上皮細(xì)胞建立氣道炎癥反應(yīng)的體外模型,檢測連環(huán)素p120(p120)表達(dá)變化及其對NF-κB信號通路的影響,初步探討香煙煙霧所致氣道炎癥的分子機制。 二、方法 根據(jù)本實驗室經(jīng)驗及相關(guān)文獻制備100%CSE溶液,采用MTT檢測不同濃度CSE(1%,5%,10%,15%,20%,30%,40%,50%)對細(xì)胞活力的影響。根據(jù)MTT結(jié)果,選用15%CSE作用不同時間,采用Western blot檢測p120、IκBα及p-IκBa蛋白的表達(dá)變化,并采用Real-time PCR檢測p120mRNA水平；運用免疫熒光、核漿分離提取蛋白技術(shù)檢測NF-κB p65蛋白表達(dá)及分布的改變；采用ELISA和Real-time PCR檢測IL-8蛋白及mRNA表達(dá)水平的改變。采用瞬時轉(zhuǎn)染特異性p120siRNA敲低上皮細(xì)胞中p120的表達(dá)或采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染p1201A和3A質(zhì)粒,觀察CSE刺激下p120表達(dá)水平變化對NF-κB信號通路的影響。 三、結(jié)果 1.MTT結(jié)果顯示15%CSE刺激24h后氣道上皮細(xì)胞仍保持80%的活力,但20%CSE作用后細(xì)胞活力降至40%。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)p120主要以亞型3存在于人氣道上皮細(xì)胞,其表達(dá)下調(diào)呈濃度和時間依賴性。Real-time PCR結(jié)果顯示p120mRNA含量也一致性減少。 2.15%CSE刺激人氣道上皮細(xì)胞后,Western blot檢測顯示IκBα表達(dá)減少而p-IκBα水平增加；細(xì)胞核漿分離提蛋白后Western blot檢測發(fā)現(xiàn)NF-κB p65蛋白胞質(zhì)表達(dá)減少,而核內(nèi)表達(dá)增加；免疫熒光染色也證實NF-κB p65發(fā)生核轉(zhuǎn)位。同時,Real-time PCR和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)前炎癥因子IL-8(NF-κB信號下游的靶基因)蛋白及mRNA的表達(dá)隨刺激時間的延長顯著增加。 3.采用siRNA沉默p120在氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)后給予15%CSE刺激,雖然NF-κB總蛋白含量沒有變化,但其在Ser536位點的磷酸化顯著增加,與Scramble組比較,差異具有顯著性(P0.05)。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)IL-8、IL-1β及IL-6的表達(dá)水平較Scramble組也顯著增加(P0.001)。 4.轉(zhuǎn)染p1201A和3A質(zhì)粒入氣道上皮細(xì)胞后給予15%CSE刺激,雖然NF-κB總蛋白沒有改變,但其在Ser536位點的磷酸化相對于MT組顯著降低,差異具有顯著性(P0.05)。同時,ELISA檢測發(fā)現(xiàn)IL-8、IL-1p及IL-6的表達(dá)水平較MT組顯著減少(P0.001)。 四、結(jié)論 在CSE誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)中,p120可能通過NF-κB信號通路發(fā)揮調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用。 第二部分氣道炎癥反應(yīng)中p120活化NF-κB信號通路的可能機制 一、目的 通過檢測CSE刺激后RhoA/ROCK的活性和蛋白水平變化以及另一種粘附連接蛋白E-cadherin的表達(dá)變化,進一步探討氣道炎癥反應(yīng)中p120活化NF-κB信號通路的可能分子機制。 二、方法 首先采用CSE刺激復(fù)制氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型,然后加入ROCK抑制劑Y27632抑制RhoA/ROCK信號,瞬時轉(zhuǎn)染特異性p120siRNA沉默p120或p1203A質(zhì)粒外源性過表達(dá)p120,并轉(zhuǎn)染不能結(jié)合RhoA的p120突變質(zhì)粒(p120DRDD-GFP)及不能結(jié)合E-cadherin的p120突變質(zhì)粒(p120DEcad-GFP),采用Western blot檢測p120、 E-cadherin、 NF-κB p65、 RhoA及ROCK1的蛋白表達(dá)；免疫共沉淀技術(shù)檢測p120與RhoA結(jié)合情況；免疫熒光和ELISA技術(shù)檢測NF-κB p65的定位和Ser536位點的磷酸化情況；G-LISA技術(shù)檢測RhoA活性的變化。 三、結(jié)果 1.15%CSE刺激后,Western blot結(jié)果顯示雖然RhoA總蛋白沒有變化,但是下游蛋白ROCK1的表達(dá)增加：粘附連接蛋白E-cadherin的表達(dá)減少。 2.免疫共沉淀結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞中p120與RhoA存在于同一復(fù)合物中。15%CSE作用下,雖然與p120結(jié)合的RhoA蛋白改變不明顯,但G-LISA檢測顯示RhoA活性顯著上升。 3. siRNA沉默p120后,在15%CSE刺激后氣道上皮細(xì)胞內(nèi)雖然RhoA,總蛋白無變化,但ROCK1的表達(dá)增加。G-LISA檢測也顯示RhoA的活性顯著上升,與Scramble組比較,差異顯著(P0.05)。過表達(dá)p1203A后,在15%CSE刺激后氣道上皮細(xì)胞內(nèi)的RhoA和ROCK1的表達(dá)都減少。G-LISA檢測也顯示,相對于MT組RhoA活性顯著降低。 4.采用Y27632抑制RhoA/RCOK1信號通路后,免疫熒光發(fā)現(xiàn)NF-κB p65的入核被部分抑制；ELISA技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)NF-κB p65(Ser536)的磷酸化也減少。 5.轉(zhuǎn)染p120DRDD-GFP質(zhì)粒后,發(fā)現(xiàn)即使在15%CSE刺激下,RhoA和ROCK1的表達(dá)都無明顯變化；NF-κB p65(Ser536)的磷酸化和RhoA活性也沒有變化。而轉(zhuǎn)染p120DEcad-GFP質(zhì)粒后,雖然NF-κB p65的表達(dá)沒有變化,但RhoA的表達(dá)減少,NF-κB p65(Ser536)的磷酸化減少,RhoA舌性也降低。 四、結(jié)論 1.人氣道上皮中,p120可以與RhoA結(jié)合,CSE刺激可以激活RhoA/ROCK信號。 2.沉默p120可增強CSE誘導(dǎo)的RhoA/ROCK信號的活化,而過表達(dá)p1203A可部分抑制CSE誘導(dǎo)的RhoA/ROCK信號的激活。 3.抑制劑Y27632抑制RhoA/ROCK信號通路后,CSE誘導(dǎo)的NF-κB活化被部分抑制。 4.p120不能與RhoA結(jié)合后,不能活化NF-κB信號通路；而不能與E-cadherin結(jié)合后,活化NF-κB信號通路不受影響。 由此可見,氣道炎癥反應(yīng)中p120可能通過RhoA/ROCK活化NF-κB信號通路,而且不依賴E-cadherin。
【關(guān)鍵詞】：人氣道上皮細(xì)胞 CSE p120 NF-κB 炎癥反應(yīng) CSE p120 RhoA/ROCK NF-κB 炎癥反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R56
【目錄】：

• 主要~.略詞7-8
• 中文摘要8-12
• Abstract12-17
• 第一部分17-52
• 前言17-19
• 材料和方法19-33
• 結(jié)果33-43
• 討論43-46
• 參考文獻46-52
• 第二部分52-72
• 前言52-54
• 材料和方法54-59
• 結(jié)果59-66
• 討論66-68
• 參考文獻68-72
• 綜述72-92
• 參考文獻81-92
• 附錄92-93
• 致謝93

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本文編號：598269