本文關(guān)鍵詞：舒林酸抗肺纖維化的作用及其對STAT3相關(guān)miR-21表達(dá)抑制

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【摘要】：目的：探討舒林酸(sulindac)通過抑制IFN-y誘導(dǎo)的STAT3/p-STAT3通路相關(guān)miRNA-21表達(dá)緩解肺纖維化損傷的機(jī)制。方法：用博萊霉素誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠肺纖維化模型,轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-1)誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)構(gòu)建肺纖維化細(xì)胞模型,用舒林酸、IFN-γ、AG490干預(yù)及miR-21轉(zhuǎn)染。倒置顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及E-cadherin、α-SMA的表達(dá)；western blot檢測EMT標(biāo)志性蛋白E-cadherin、α-SMA和Stat3/p-Stat3的表達(dá)變化；IHC、ELISA檢測IFN-γ表達(dá)；RT-qPCR檢測miR-21表達(dá)。結(jié)果：舒林酸治療組大鼠肺干濕比、肺泡間隔增寬、膠原沉積等指標(biāo)較博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型組減弱。舒林酸抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT形態(tài)學(xué)變化,且上調(diào)E-cadherin表達(dá),下調(diào)a-SMA表達(dá)逆轉(zhuǎn)EMT。舒林酸減弱肺纖維化中IFN-Y表達(dá)；IFN-γ以劑量依賴方式上調(diào)Stat3及p-Stat3表達(dá)；舒林酸下調(diào)Stat3及p-Stat3表達(dá)；舒林酸抑制IFN-γ誘導(dǎo)的STAT3信號通路。miR-21是STAT3信號通路下游miRNA;舒林酸下調(diào)miR-21表達(dá); IFN-γ上調(diào)miR-21表達(dá)；miR-21誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT形態(tài)學(xué)變化,且下調(diào)E-cadherin表達(dá),上調(diào)α-SMA表達(dá)促EMT；舒林酸抑制miR-21誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT形態(tài)學(xué)變化,且上調(diào)E-cadherin表達(dá),下調(diào)a-SMA表達(dá)逆轉(zhuǎn)EMT。結(jié)論：舒林酸緩解肺纖維化發(fā)生,可能與抑制IFN-γ誘導(dǎo)的STAT3/p-STAT3信號通路的活化進(jìn)而下調(diào)通路下游miR-21表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：肺纖維化 舒林酸 STAT3 IFN-γ EMT miR-21
【學(xué)位授予單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563.9
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 縮略詞表9-10
• 前言10-16
• 參考文獻(xiàn)11-16
• 第一部分 探討舒林酸是否具有抗肺纖維化作用16-30
• Part1 舒林酸在BLM誘導(dǎo)大鼠肺纖維化損傷中的作用16-25
• 1 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物16
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑16
• 1.3 主要儀器16
• 1.4 常用試劑配制16-17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-22
• 2.1 動物模型分組與模型制備17-18
• 2.2 動物模型取材18
• 2.3 石蠟切片制備18
• 2.4 HE染色18-19
• 2.5 Masson染色19
• 2.6 羥脯氨酸檢測19-20
• 2.7 Western blotting檢測E-cadherin、α-SMA的表達(dá)變化20-22
• 3 統(tǒng)計分析22
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-25
• 4.1 HE染色觀察大鼠肺組織形態(tài)改變22
• 4.2 Masson染色觀察大鼠肺組織的膠原表達(dá)22-23
• 4.3 大鼠肺組織膠原的定量表達(dá)23
• 4.4 大鼠肺組織HYP含量檢測23-24
• 4.5 Western blotting檢測sulindac對大鼠肺組織E-cadherin、a-SMA表達(dá)影響24-25
• Part2 舒林酸逆轉(zhuǎn)A549細(xì)胞的EMT過程25-30
• 1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 1.1 細(xì)胞系25
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑25
• 1.3 主要儀器25
• 1.4 常用試劑配制25-26
• 2 實(shí)驗(yàn)方法26-27
• 2.1 A549細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存26
• 2.2 細(xì)胞加藥實(shí)驗(yàn)26-27
• 3 統(tǒng)計分析27
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-30
• 4.1 Western blotting檢測TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞E-cadherin、a-SMA表達(dá)變化27
• 4.2 A549細(xì)胞sulindac干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察27-28
• 4.3 Western blotting檢測A549細(xì)胞sulindac干預(yù)后E-cadherin、α-SMA表達(dá)變化28-30
• 第二部分 探討舒林酸抗肺纖維化的可能機(jī)制30-53
• Part1 舒林酸對肺纖維化中IFN-γ表達(dá)的影響30-36
• 1 實(shí)驗(yàn)材料30
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物30
• 1.2 細(xì)胞系30
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑30
• 1.4 主要儀器30
• 1.5 常用試劑配制30
• 2 實(shí)驗(yàn)方法30-32
• 2.1 動物模型分組與模型制備31
• 2.2 動物模型取材31
• 2.3 石蠟切片制備31
• 2.4 免疫組化31-32
• 2.5 Western blotting檢測IFN-γ因子的表達(dá)變化32
• 2.6 A549細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存32
• 2.7 細(xì)胞加藥實(shí)驗(yàn)32
• 2.8 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)32
• 3 統(tǒng)計分析32
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-36
• 4.1 IHC觀察sulindac對大鼠肺組織IFN-γ表達(dá)影響32-33
• 4.2 IHC檢測sulindac對大鼠肺組織IFN-γ表達(dá)影響的IOD分析33-34
• 4.3 Western Blotting檢測sulindac對大鼠肺組織IFN-γ表達(dá)影響34
• 4.4 ELISA檢測sulindac對A549細(xì)胞IFN-γ表達(dá)的影響34-36
• Part2 舒林酸對IFN-γ誘導(dǎo)的STAT3信號通路的抑制36-40
• 1 實(shí)驗(yàn)材料36
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物36
• 1.2 細(xì)胞系36
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑36
• 1.4 主要儀器36
• 1.5 常用試劑配制36
• 2 實(shí)驗(yàn)方法36-37
• 2.1 動物模型分組與模型制備36
• 2.2 動物模型取材36
• 2.3 A549細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存36-37
• 2.4 細(xì)胞加藥實(shí)驗(yàn)37
• 2.5 Western blotting檢測stat3、P-stat3的表達(dá)變化37
• 3 統(tǒng)計分析37
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-40
• 4.1 Western Blotting檢測sulindac對大鼠肺組織stat3、P-stat3表達(dá)影響37
• 4.2 Western Blotting檢測IFN-γ干預(yù)的A549細(xì)胞stat3、P-stat3表達(dá)改變37-38
• 4.3 Western Blotting檢測IFN-γ、AG490干預(yù)的A549細(xì)胞stat3、P-stat3表達(dá)改變38
• 4.4 Western Blotting檢測sulindac、AG490干預(yù)的A549細(xì)胞stat3、P-stat3表達(dá)改變38-40
• Part3 miR-21對A549細(xì)胞的EMT的影響40-44
• 1 實(shí)驗(yàn)材料40
• 1.1 細(xì)胞系40
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑40
• 1.3 主要儀器40
• 1.4 常用試劑配制40
• 2 實(shí)驗(yàn)方法40-41
• 2.1 A549細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存40
• 2.2 miRNA化學(xué)合成40
• 2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)40-41
• 2.4 Western blotting檢測E-cadherin、a-SMA的表達(dá)變化41
• 3 統(tǒng)計分析41
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-44
• 4.1 A549細(xì)胞miR-21轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察41-42
• 4.2 Western blotting檢測A549細(xì)胞miR-21轉(zhuǎn)染后E-cadherin、α-SMA表達(dá)變化42-44
• Part4 舒林酸減弱STAT3信號通路相關(guān)miR-21的表達(dá)44-49
• 1 實(shí)驗(yàn)材料44
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物44
• 1.2 細(xì)胞系44
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑44
• 1.4 主要儀器44
• 1.5 常用試劑配制44
• 2 實(shí)驗(yàn)方法44-46
• 2.1 動物模型分組與模型制備44
• 2.2 動物模型取材44
• 2.3 A549細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存44
• 2.4 細(xì)胞加藥實(shí)驗(yàn)44-45
• 2.5 組織及細(xì)胞RNA提取45
• 2.6 miR-21的加尾及反轉(zhuǎn)錄45-46
• 2.7 PCR反應(yīng)46
• 3 統(tǒng)計分析46
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-49
• 4.1 QRT-PCR檢測sulindac對大鼠肺組織miR-21表達(dá)影響46-47
• 4.2 QRT-PCR檢測IFN-γ、AG490干預(yù)的A549細(xì)胞miR-21表達(dá)改變47
• 4.3 QRT-PCR檢測sulindac、AG490干預(yù)的A549細(xì)胞miR-21表達(dá)改變47-49
• Part5 舒林酸抑制miR-21誘導(dǎo)的EMT49-53
• 1 實(shí)驗(yàn)材料49
• 1.1 細(xì)胞系49
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑49
• 1.3 主要儀器49
• 1.4 常用試劑配制49
• 2 實(shí)驗(yàn)方法49-50
• 2.1 A549細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存49
• 2.2 細(xì)胞加藥實(shí)驗(yàn)49
• 2.3 Western blotting檢測E-cadherin、a-SMA的表達(dá)變化49-50
• 2.4 Immunofluorescence檢測E-cadherin、a-SMA的表達(dá)變化50
• 3 統(tǒng)計分析50
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-53
• 4.1 A549細(xì)胞sulindac及miR-21干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察50
• 4.2 Western blotting檢測A549細(xì)胞sulindac及miR-21干預(yù)后E-cadherin、α-SMA表達(dá)變化50-51
• 4.3 Immunofluorescence檢測A549細(xì)胞sulindac及miR-21干預(yù)后E-cadherin、α-SMA表達(dá)變化51-53
• 討論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-57
• 文獻(xiàn)綜述 γ干擾素在特發(fā)性肺纖維化中的相關(guān)研究進(jìn)展57-65
• 1 IFN-γ概述58
• 2 IFN-γ與IPF相關(guān)信號通路58-59
• 3 IFN-γ與IPF相關(guān)miRNA表達(dá)59-60
• 4 IFN-γ與IPF過程中血管再生60
• 5 IFN-γ與Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡60-61
• 6 IFN-γ治療IPF的探索61-62
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 致謝65-66
• 研究生期間發(fā)表的文章66

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本文編號：536626