發(fā)布時間：2017-06-24 08:20

  本文關(guān)鍵詞：血管緊張素Ⅱ?qū)θ藲獾榔交〖?xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白及增殖的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、研究背景 支氣管哮喘(Bronchial asthma, asthma)是一種多細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié),以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主的多種細(xì)胞(包括炎癥細(xì)胞及結(jié)構(gòu)細(xì)胞)參與的慢性氣道炎癥性疾病。哮喘在全球范圍內(nèi)均是常見的慢性呼吸道疾病,且患病率呈逐年增長趨勢。哮喘具有以下三大特征：慢性氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性(Airway hyperresponsiveness,AHR),其中氣道重塑正日益成為人們研究的重點(diǎn)及熱點(diǎn),這種重塑涉及氣道各層組織,包括氣道壁增厚和基質(zhì)沉積,上皮下纖維化,平滑肌增生和肥大,肌成纖維細(xì)胞增殖及黏液腺、杯狀細(xì)胞化生及增生,上皮下網(wǎng)狀層增厚,微血管生成等。目前研究認(rèn)為氣道炎癥與氣道高反應(yīng)性、氣道重塑密切相關(guān),炎癥、損傷、修復(fù)和重塑是一個不斷進(jìn)展的病理過程,最終導(dǎo)致氣道壁增厚,促使氣道狹窄和氣流受限,并可形成頑固性哮喘。近年來在哮喘方面的研究發(fā)現(xiàn),哮喘患者氣道壁中存在著細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)過度沉積,且與非哮喘患者相比,ECM蛋白的成分及構(gòu)成比例均發(fā)生了較大的變化。ECM是指由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間質(zhì)中的大分子物質(zhì)所構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),主要成分有膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白,起著支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動的作用。此外,ECM還具有影響細(xì)胞分化、增殖、粘附、形態(tài)發(fā)生和表型表達(dá)的作用。 既往觀點(diǎn)認(rèn)為,氣道平滑肌細(xì)胞(Airway smooth muscle cell, ASMC)作為一種被動的結(jié)構(gòu)細(xì)胞,僅在炎癥介質(zhì)的刺激下發(fā)揮調(diào)控氣道舒縮的功能,相關(guān)研究亦多著眼于炎癥介質(zhì)或神經(jīng)遞質(zhì)對氣道平滑肌的收縮作用以及內(nèi)源性或外源性支氣管舒張物質(zhì)對支氣管平滑肌的松弛作用。但新近研究證據(jù)表明,ASMC還能發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,合成分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、粘附因子及ECM,主動參與哮喘氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展的全過程,進(jìn)而加重氣道重塑和AHR。體外實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)人氣道平滑肌細(xì)胞(Human airway smooth muscle cell, HASMC)可分泌包括Ⅰ型膠原蛋白(Type1collagen, COL-Ⅰ)、纖維粘連蛋白(FN)在內(nèi)的多種ECM蛋白,且ECM蛋白可影響體外HASMC的增殖和遷移。因此,有學(xué)者提出應(yīng)把ASMC作為哮喘研究的新靶點(diǎn),通過對其表型轉(zhuǎn)化和合成、分泌作用的深入研究,以期為哮喘的治療提供新方法。由于哮喘患者的ASMC難以獲得,國內(nèi)外研究均以哮喘血清被動致敏HASMC。且國外研究證實(shí),體外培養(yǎng)的被動致敏HASMC與正常人血清處理相比,其所分泌的ECM蛋白成分及含量均明顯不同。因此,以哮喘血清被動致敏HASMC進(jìn)行研究有助于了解ASMC在哮喘疾病進(jìn)展中的作用和地位。 細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signalregulated kinase, ERK)信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與了哮喘氣道慢性炎癥、AHR和氣道平滑肌的增殖等多種病理生理過程。目前國內(nèi)主要在哮喘動物模型基礎(chǔ)上對ERK信號通路在平滑肌細(xì)胞增殖、遷移等方面進(jìn)行研究。XIE Shao-ping等在體外培養(yǎng)HASMC上的實(shí)驗(yàn)表明,抑制ERK信號通路可抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的結(jié)締組織生長因子(CTGF) mRNA、蛋白表達(dá)及CTGF下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Smad2/3的磷酸化。Johnson等研究表明,哮喘ASMC和非哮喘ASMC均呈ERK依耐性表達(dá)COL-I和FN, ERK信號通路參與了CTGF刺激HASMC分泌ECM蛋白的過程。綜上所述,我們推測ERK信號通路在HASMC分泌ECM蛋白中起著重要的作用。 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Rennin-angiotensin system, RAS)作為經(jīng)典的循環(huán)激素系統(tǒng),經(jīng)過50余年的研究,被證實(shí)不僅是一種循環(huán)激素,更是一種組織和局部激素,廣泛存在于心、腦、肝、腎、血管、脂肪、骨髓、生殖和胚胎等器官或組織中,發(fā)揮自分泌、旁分泌和局部激素作用,除參與各種心血管和腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展外,還與肺疾病轉(zhuǎn)歸及預(yù)后有關(guān)。血管緊張素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)作為RAS中的重要效應(yīng)物質(zhì),除具調(diào)節(jié)血管張力、血流及促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖等作用外,尚有致炎作用,通過與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等多種炎癥介質(zhì)表達(dá)的作用,參與機(jī)體炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ1型受體(Angiotensin Ⅱ type1receptor, AT1R)、血管緊張素Ⅱ2型受體(AT2R)、血管緊張素Ⅱ3型受體(AT3R)、血管緊張素Ⅱ4型受體(AT4R)四種Ang Ⅱ受體亞型,在人及嚙齒類動物中以AT1R和AT2R為主。近年來,大量研究表明Ang Ⅱ主要是通過與AT1R結(jié)合,從而發(fā)揮其經(jīng)典作用。除心、腎、腦、血管等組織器官外,有學(xué)者在肺組織中也檢測到了AT1R。在心、肝、腎纖維化方面的大量研究表明,AngⅡ可促進(jìn)包括腎小球系膜細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)在內(nèi)的多種細(xì)胞分泌多種ECM蛋白(膠原蛋白、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸等),參與組織重塑,且這一作用可為AT1受體阻滯劑所阻斷。膠原蛋白(簡稱膠原)是ECM的主要結(jié)構(gòu)蛋白,COL-I是含量最高的膠原類型,也是正常及病變氣道壁主要的ECM蛋白。Carol[22]等采用[3H]-脯氨酸摻入釋放法,檢測到AngⅡ (10-7mol/L)刺激下VSMC膠原合成明顯增多,而在10倍于AngⅡ濃度的AT1R拮抗劑洛沙坦干預(yù)后膠原合成量則明顯減少。劉翠麗等通過大鼠體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí),哮喘大鼠肺組織局部存在RAS活化,增多的AngⅡ促進(jìn)ASM增殖肥大和氣道壁膠原沉積增加,AT1R拮抗劑厄貝沙坦干預(yù)可以減輕氣道重塑的發(fā)生,并對肺功能有一定的改善作用。 綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測AngⅡ可能通過與ASMC膜上的AT1R結(jié)合促進(jìn)被動致敏的HASMC分泌COL-Ⅰ,ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能是其下游通路。富含COL-I等ECM組分的細(xì)胞培養(yǎng)上清可能對HASMC增殖具有促進(jìn)作用。 二、研究目的 通過采血并分離哮喘急性發(fā)作期患者血清,被動致敏體外培養(yǎng)的HASMCs,模擬哮喘ASMC,并以AngⅡ、AT1R拮抗劑洛沙坦及ERKl/2信號通路抑制劑PD98059處理被動致敏后的HASMCs,以僅加哮喘血清組作為對照,初步研究AngⅡ?qū)Ρ粍又旅舻腍ASMCs分泌COL-I的影響及其可能機(jī)制,并用上述細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激HASMCs,初步了解COL-I含量不同的細(xì)胞培養(yǎng)上清對HASMCs增殖的影響,以期為哮喘氣道重塑的防治提供新的靶點(diǎn)。 三、材料和方法 1.人氣道平滑肌細(xì)胞(HASMC)的分離培養(yǎng)與鑒定：無菌狀態(tài)下,取我院胸外科肺腫瘤患者肺葉切除術(shù)后腫瘤旁遠(yuǎn)端正常支氣管組織。按照相關(guān)文獻(xiàn)報道和本課題小組已經(jīng)成熟的方法,采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行原代HASMC的培養(yǎng),采用自然及人工方法純化細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長及形態(tài),并用抗平滑肌a-肌動蛋白(a-SM actin)抗體行免疫熒光細(xì)胞染色鑒定為HASMC。取3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 2.實(shí)驗(yàn)分組：將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為以下6組：①：哮喘血清被動致敏組：加入含10%哮喘血清的DMEM;②被動致敏+Ang Ⅱ組：含10%哮喘血清的DMEM+Ang Ⅱ(終濃度為10-7mol/l)；③被動致敏+Losartan組：含10%哮喘血清的DMEM+Losartan (終濃度為10-6mol/l);④被動致敏+Ang Ⅱ+Lostarn組：含10%哮喘血清的DMEM+AngⅡ(終濃度為10-7mol/l)+Losartan(終濃度為10-6mol/l);⑤被動致敏+PD98059組：含10%哮喘血清的DMEM+PD98059(終濃度為10-5mol/l)⑥被動致敏+Ang Ⅱ+PD98059組：含10%哮喘血清的DMEM+Ang Ⅱ(終濃度為10-7mol/l)+PD98059(終濃度為10-5mol/l)。 3.天狼猩紅苦味酸染色觀察HASMC是否表達(dá)膠原蛋白。 4.實(shí)時熒光定量PCR法檢測COL-ImRNA表達(dá)情況。 5.酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中COL-Ⅰ蛋白的濃度情況。 6.MTT法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清對HASMC是否有促增殖作用。 7.實(shí)驗(yàn)所得原始數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,利用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 四、結(jié)果 1.倒置顯微鏡在X100倍鏡下觀察,HASMCs未匯合之前多呈長梭形或多邊形,細(xì)胞匯合后部分區(qū)域的細(xì)胞成束狀排列,呈現(xiàn)起伏狀生長,呈典型“峰與谷”狀,對平滑肌細(xì)胞特異的a-肌動蛋白(aSM-actin)進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞染色,在x200高倍鏡下可見aSM-actin在氣道平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)均勻分布,呈綠色熒光。傳至第3-4代,平滑肌細(xì)胞純度為95%。 2.苦味酸天狼猩紅染色 膠原蛋白分子富含堿性氨基酸,可與酸性染料起強(qiáng)烈反應(yīng)。天狼猩紅(Sirius red)為一種強(qiáng)酸性染料,能與膠原蛋白強(qiáng)力結(jié)合。普通光鏡下,天狼猩紅染色膠原蛋白呈紅色。細(xì)胞爬片染色后,普通光鏡下觀察見HASMC胞漿呈紅色。 3.AngⅡ?qū)Ρ粍又旅鬑ASMC COL-ImRNA表達(dá)的影響 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示,AngⅡ(10-7mol/l)可促進(jìn)被動致敏HASMCs COL-ImRNA表達(dá),與對照組相比增殖幅度達(dá)1.63±0.96倍(P0.01)。在血管緊張素AT1R特異性阻斷劑洛沙坦(Losartan)存在的情況下,AngⅡ?qū)Ρ粍又旅鬑ASMCs COLImRNA表達(dá)的促進(jìn)作用降至1.02±0.61倍(P0.01)。ERKl/2信號通路拮抗劑PD98059預(yù)處理30min后,AngⅡ誘導(dǎo)HASMCs分泌的COLI蛋白濃度降至1.17±0.46倍(P0.01)。 4. AngⅡ?qū)Ρ粍又旅鬑ASMC COLI的促分泌作用 Elisa結(jié)果顯示,AngⅡ (10-7mol/l)可促進(jìn)被動致敏HASMCs分泌COLI蛋白,濃度可達(dá)86.94±6.25ng/ml (P0.01)。在血管緊張素AT1受體特異性阻斷劑洛沙坦(ARB)存在的情況下,AngⅡ處理后HASMCs分泌的COLI蛋白濃度降至55.55±3.29ng/ml (P0.01)。ERK1/2信號通路拮抗劑PD98059預(yù)處理30min后,AngⅡ誘導(dǎo)HASMCs分泌的COLI蛋白濃度降至55.92±5.19ng/ml (P 0.01)。 5.細(xì)胞培養(yǎng)上清對HASMCs增殖的影響。 MTT結(jié)果顯示,與對照的單純哮喘血清刺激組細(xì)胞培養(yǎng)上清相比較,AngⅡ (10-7mol/l)+哮喘血清刺激組的細(xì)胞培養(yǎng)上清可促進(jìn)HASMCs增殖(p0.01)。加入特異性AT1受體拮抗劑洛沙坦預(yù)處理HASMCs30min后,被動致敏+AngⅡ+Lostarn組與Ang Ⅱ (10-7mol/l)+哮喘血清刺激組比較,其細(xì)胞培養(yǎng)上清對HASMCs增殖促進(jìn)作用明顯下降(p0.01),但與單純哮喘血清刺激組比較,仍有顯著性差異(p0.05)；加入ERKl/2信號傳導(dǎo)通路抑制劑PD98059預(yù)處理HASMCs30min后,被動致敏+Ang Ⅱ+PD98059組與Ang Ⅱ (10-7mol/l)+哮喘血清刺激組比較其細(xì)胞培養(yǎng)上清對HASMCs增殖促進(jìn)作用明顯下降(p0.01),但與單純哮喘血清刺激組比較,仍有顯著性差異(p0.05)；表明富含COL-1等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清對HASMCs增殖具有一定的促進(jìn)作用,AT1受體拮抗劑具有一定間接減弱作用。 五、結(jié)論 本研究從被動致敏HASMC入手,發(fā)現(xiàn)AngⅡ (10-7mol/l)處理組有關(guān)COLI的結(jié)果檢測均與單純被動致敏組明顯不同。COL Ⅰ-α1mRNA表達(dá)水平及蛋白含量顯著高于單純被動致敏組,表明AngⅡ (10-7mol/l)有促進(jìn)被動致敏HASMC分泌COLI的作用。為了驗(yàn)證AngⅡ的促分泌作用是否通過AT1受體介導(dǎo),我們加入AT1受體拮抗劑洛沙坦(10-6mol/l)干預(yù)。結(jié)果表明,與被動致敏-Ang Ⅱ組相比,被動致敏+Ang Ⅱ+Lostarn組COL Ⅰ-α1mRNA表達(dá)水平及蛋白含量均明顯下降,與單純被動致敏組相比無統(tǒng)計學(xué)差異,表明AngⅡ?qū)Ρ粍又旅鬑ASMC分泌COLI的促進(jìn)作用主要是由AT1R介導(dǎo)的,AT1受體拮抗劑洛沙坦可阻斷這一作用。為了驗(yàn)證AngⅡ是否通過ERK1/2通路發(fā)揮其促分泌作用,我們在加入AngⅡ前30min加入PD98059(10-5mol/l)預(yù)處理。結(jié)果表明,與被動致敏+AngⅡ組相比,被動致敏+Ang Ⅱ+PD98059組COL Ⅰ-almRNA表達(dá)水平及蛋白含量均明顯下降,與單純被動致敏組相比無統(tǒng)計學(xué)差異,表明AngⅡ可能通過ERK1/2通路發(fā)揮其促分泌作用。 MTT結(jié)果顯示,AngⅡ組COL-I含量較高的細(xì)胞培養(yǎng)上清,對HASMCs增殖具有一定的促進(jìn)作用。 綜上所述, HASMC在AngⅡ等刺激因素作用下可分泌過多的COL-I等ECM組分,而改變后的ECM反過來作用于HASMC,促進(jìn)其增殖,表明ECM沉積變化在哮喘氣道重塑中具有重要作用
【關(guān)鍵詞】：被動致敏 人氣道平滑肌細(xì)胞 AngⅡ ECM蛋白 增殖
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R562.25
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-21
• 第一部分 AngⅡ?qū)Ρ粍又旅鬑ASMC分泌COL-I的影響21-48
• 材料與方法21-31
• 結(jié)果31-35
• 討論35-43
• 結(jié)論43
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 第二部分 細(xì)胞培養(yǎng)上清對HASMC增殖的影響48-58
• 材料與方法48-50
• 結(jié)果50-52
• 討論52-56
• 結(jié)論56
• 參考文獻(xiàn)56-58
• 全文小結(jié)58-60
• 中英文對照縮略詞表60-61
• 致謝61-63

【參考文獻(xiàn)】

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1 牛毅;程遠(yuǎn)雄;李寧;沈彬;謝浩俊;;ERK信號通路在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人氣道平滑肌細(xì)胞增殖中的作用[J];廣東醫(yī)學(xué);2013年03期

2 錢效森,林耀廣,孫梅勵;豚鼠支氣管哮喘時血管緊張素系統(tǒng)的變化及糖皮質(zhì)激素對其的作用[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2000年06期

  本文關(guān)鍵詞：血管緊張素Ⅱ?qū)θ藲獾榔交〖?xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白及增殖的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：477603