發(fā)布時間：2017-06-13 16:02

  本文關鍵詞：雷帕霉素誘導的細胞自噬在氣道和肺部炎癥中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分細胞自噬在OVA誘導的小鼠氣道炎癥中的作用及其機制研究[研究背景]支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種炎癥細胞特別是肥大細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞等共同參與的慢性氣道炎癥性疾病,其發(fā)病機制尚未完全明了。細胞自噬能降解細胞器和蛋白質(zhì),在維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬與哮喘具有相關性,但是細胞自噬在哮喘中的作用及其具體的作用機制尚未完全明確,值得進一步探討。[目的]建立OVA誘導的小鼠哮喘模型。觀察哮喘模型中細胞自噬水平的變化,探討細胞自噬在OVA誘導的小鼠哮喘模型中的作用和發(fā)揮作用的可能機制。[方法]健康雌性BALB/c小鼠,以卵白蛋白(OVA)致敏和激發(fā)建立小鼠哮喘模型。隨機分為四組：生理鹽水對照組(Control組)、哮喘組(OVA組)、雷帕霉素組(OVA+Rapa組)和氯喹組(OVA+CQ組)。雷帕霉素組(4mg/kg)和氯喹組(30mg/kg)在每次抗原激發(fā)前1小時進行腹腔注射。最后一次抗原激發(fā)后24小時內(nèi)行肺組織HE染色和PAS染色分別觀察氣道炎癥細胞浸潤和粘液分泌；檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞總數(shù)和細胞分類計數(shù)；酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測BALF和血清中細胞因子IL-4, IL-13, TGF-β和IFN-y的表達；Real-time RT-PCR檢測肺組織MUC5AC mRNA的表達；透射電鏡觀察小鼠氣道上皮細胞內(nèi)自噬體；Real-time RT-PCR檢測自噬相關基因Atg5 mRNA和Atg7mRNA的表達；Western blot檢測肺組織內(nèi)自噬標志蛋白LC3(microtubule-associated protein light chain 3)的表達。雷帕霉素和氯喹分別預處理哮喘小鼠,檢測自噬指標的變化,探討細胞自噬發(fā)揮作用的可能機制。[結果]OVA誘導的小鼠肺組織病理見氣道炎癥細胞浸潤和粘液分泌增多；BALF中細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞計數(shù)較對照組顯著增加；BALF中IL-4,IL-13和TGF-β表達顯著升高,IFN-y表達顯著下降；血清中IL-4和IL-13表達顯著升高；肺組織MUC5ACmRNA表達明顯增加。雷帕霉素和氯喹預處理顯著改善OVA誘導的氣道炎癥和粘液分泌。透射電鏡觀察OVA誘導的哮喘小鼠氣道上皮細胞中自噬體增加；Atg5mRNA和Atg7mRNA表達增加；自噬標志蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化增加。雷帕霉素預處理后細胞自噬水平增加。氯喹能夠抑制自噬溶酶體的降解,細胞內(nèi)自噬體數(shù)量增加,細胞自噬水平增加。[結論]OVA誘導的小鼠哮喘模型中,氣道炎癥增加,雷帕霉素和氯喹可以緩解OVA誘導的氣道炎癥。OVA誘導細胞自噬水平增加,雷帕霉素和氯喹預處理后細胞自噬水平進一步增加。所以我們推測雷帕霉素和氯喹通過增加了OVA誘導的哮喘小鼠的細胞自噬而對哮喘發(fā)揮保護作用。我們的研究提示細胞自噬信號通路有望成為哮喘防治的靶點。第二部分細胞自噬在LPS誘導的急性肺損傷肺部炎癥中的作用及其機制研究[研究背景]急性肺損傷(Acute Lung Injury, ALI)和急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由多種病因誘發(fā)的肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞損傷、氧合功能嚴重障礙,表現(xiàn)為彌漫性肺浸潤和呼吸窘迫的綜合癥。其發(fā)病機制尚未完全明了。細胞自噬能降解細胞器和蛋白質(zhì),在維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬與ALI具有相關性,但是細胞自噬在ALI中的作用及其具體的作用機制尚未完全明確,值得進一步探討。[目的]建立脂多糖(LPS)誘發(fā)的小鼠急性肺損傷模型。觀察急性肺損傷中細胞自噬水平的變化,探討細胞自噬在肺損傷中的作用及發(fā)揮作用的可能機制。[方法]健康雄性C57BL/6小鼠,LPS經(jīng)氣管插管滴入建立小鼠急性肺損傷模型。隨機分為四組：生理鹽水對照組(Control組)、急性肺損傷組(LPS組)、雷帕霉素組(LPS+Rapa組)和乙酰半胱氨酸組(LPS+NAC組)。LPS氣道滴入24h后觀察肺組織病理;檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞總數(shù)、總蛋白濃度和肺組織MPO活力；酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測BALF中炎癥因子TNF-α和IL-1β水平；檢測肺組織氧化應激指標(H2O2、MDA、SOD和’TAOC);透射電鏡觀察自噬體；Western blot檢測肺組織內(nèi)自噬標志蛋白LC3及其信號通路蛋白的表達水平。雷帕霉素預處理肺損傷小鼠,檢測自噬指標的變化,探討細胞自噬發(fā)揮作用的可能機制。[結果]LPS誘導小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)為廣泛的炎癥細胞浸潤,肺泡毛細血管屏障受損,肺泡間隔增寬,肺泡和肺間質(zhì)充血、水腫；BALF中細胞總數(shù)、總蛋白濃度和肺組織MPO活力增加；TNF-α和1L-1β的表達均明顯升高；氧化應激指標增強(H2O2和MDA增加,SOD活力降低)；透射電鏡提示ALI時細胞自噬增強；Western blot顯示LPS誘導肺組織內(nèi)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化增加,mTOR及P70S6磷酸化增強。雷帕霉素預處理增強細胞自噬水平,減輕肺部炎癥。[結論]雷帕霉素可以降低LPS誘導的ALI的氣道炎癥和氧化應激,發(fā)揮保護作用。LPS誘導ALI時細胞自噬水平增加,雷帕霉素預處理后,細胞自噬水平進一步增加。ALI時mTOR及其主要下游蛋白P70S6活化,雷帕霉素有抑制其活化作用。我們推測雷帕霉素是通過mTOR信號通路增加LPS誘導的細胞自噬,降低了LPS誘導的炎癥反應和氧化應激,從而發(fā)揮對ALI的保護作用。
【關鍵詞】：細胞自噬 支氣管哮喘 雷帕霉素 氯喹 氣道炎癥 細胞自噬 雷帕霉素 細菌脂多糖 急性肺損傷
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R56
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫索引11-12
• 引言12-15
• 第一部分 細胞自噬在OVA誘導的小鼠氣道炎癥中的作用及其機制研究15-40
• 前言15
• 材料與方法15-28
• 結果28-37
• 討論37-40
• 第二部分 細胞自噬在LPS誘導的急性肺損傷肺部炎癥中的作用及其機制研究40-59
• 前言40
• 材料與方法40-47
• 結果47-56
• 討論56-59
• 全文小結59-60
• 參考文獻60-64
• 綜述一64-75
• 參考文獻72-75
• 綜述二75-81
• 參考文獻78-81
• 在讀期間發(fā)表文章及會議摘要81-82
• 致謝82-83

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本文編號：446926