本文關鍵詞：細胞自噬在PM2.5誘導的氣道炎癥中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：越來越多的研究發(fā)現(xiàn),懸浮顆粒物(particulate matters,PM)是引起呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病及癌癥發(fā)病率上升和死亡率增加的重要因素之一。PM主要由工業(yè)生產(chǎn)過程高溫產(chǎn)生或是生物燃料及礦物燃料燃燒所產(chǎn)生,通過沉積于氣道或者進入肺泡,能引起或者加重多種肺部疾病。PM按空氣動力學直徑(AD)可分為粗顆粒物(AD2.5pμm)、細顆粒物(0.1μm≤AD≤2.5μm)和超細顆粒物(AD0.1μm)。PM2.5即AD≤2.5pμm的懸浮顆粒物。當顆粒物的粒徑越小,表面積越大時,顆粒沉降速度越慢,傳播距離越遠,而且能攜帶更多的有毒有害物質(zhì),對人體健康的危害也越大。研究發(fā)現(xiàn)PM暴露可誘導氣道高反應性,誘導中性粒細胞性氣道炎癥；可加重哮喘氣道炎癥,尤其是中性粒細胞性氣道炎癥,導致哮喘患者對激素治療敏感性降低,還可通過上調(diào)細胞內(nèi)氧化應激水平從而誘導氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,亦可使哮喘患者更易發(fā)生氣道重塑。 細胞自噬是細胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)的重要過程,以滿足細胞代謝、細胞與組織更新、維持細胞穩(wěn)態(tài)的需要。正常生理條件下,細胞內(nèi)保持一個低的基礎自噬水平,但是當細胞在營養(yǎng)能量缺乏、氧化應激、感染等情況下,自噬水平會迅速被上調(diào)。細胞自噬分3種類型,巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。通常說的細胞自噬即巨自噬。在細胞巨自噬過程中,來源于細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體或高爾基體的雙層膜結(jié)構(gòu)可通過包裹可溶性蛋白及某些細胞器形成自噬體,繼而與溶酶體融合形成自噬溶酶體,包裹物在溶酶體釋放的大量酸性蛋白酶的作用下得以降解和循環(huán)再利用。越來越多的證據(jù)表明細胞自噬及與之相關的調(diào)節(jié)蛋白能夠影響細胞內(nèi)很多極其重要的生理過程如細胞增殖、程序性細胞死亡、炎癥及細胞免疫功能等,因此在包括神經(jīng)性疾病、心血管疾病、炎癥性疾病和腫瘤等在內(nèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。目前已有研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬與呼吸系統(tǒng)疾病亦有關聯(lián)。細胞自噬在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷、呼吸道感染、肺動脈高壓、肺囊性纖維化、α1-胰蛋白酶缺陷、敗血癥中發(fā)揮重要作用。 另有研究證實PM暴露能夠誘導氣道上皮細胞自噬的發(fā)生,PM亦能夠引起中性粒細胞增高為主的氣道炎癥,而細胞自噬能調(diào)控急慢性氣道炎癥,提示細胞自噬也可能參與調(diào)控PM引起的氣道炎癥,目前尚未對此有報道。本課題擬以空氣動力學直徑2.5μm的懸浮顆粒物PM2.5作為研究對象,研究細胞自噬在PM2.5誘導的氣道炎癥中的作用。 目的：體外研究利用細胞自噬相關基因siRNA和抑制劑,體內(nèi)研究利用細胞自噬缺陷小鼠明確細胞自噬是否在PM2.5誘導的氣道炎癥中發(fā)揮作用。 方法：體外研究中,首先用PM2.5干預人氣道上皮細胞HBE細胞,Western blot檢測LC3B的表達,電鏡觀察自噬特征性結(jié)構(gòu)來觀察PM2.5是否能夠誘導細胞自噬,利用GFP-LC3和1RFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)入細胞后免疫熒光方法檢測進一步驗證結(jié)果,同時觀察PM2.5能否上調(diào)中性粒細胞趨化因子IL-8的表達。然后,利用自噬相關基因siRNA特異性敲除自噬相關基因,利用自噬抑制劑下調(diào)細胞自噬水平后,觀察是否能夠影響PM2.5上調(diào)IL_8的表達。 體內(nèi)研究中,6-8周齡小鼠隨機分成4組：WT/NS組、Beclin1+/-/NS、WT/PM2.5和Beclin1+/-/PM2.5組,WT/PM2.5和Beclin1+/-/PM2.5組PM2.5短期氣道滴注構(gòu)建小鼠氣道炎癥模型,WT/NS組、Beclin1+/-/NS組等量生理鹽水氣道滴注作為對照,觀察各組小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞總數(shù)、分類細胞計數(shù)、病理學改變,采用ELISA方法檢測BALF上清中小鼠中性粒細胞趨化因子KC和MIP-2的表達,Q-PCR檢測肺組織勻漿中KC和MIP-2的表達。 結(jié)果：體外實驗中,PM2.5100μg/ml干預24小時后,HBE細胞LC3B表達明顯增加。在透射電鏡下可見細胞內(nèi)黑色顆粒物周圍出現(xiàn)空泡狀雙層膜樣結(jié)構(gòu),正在或者已經(jīng)形成自噬體,并與溶酶體融合、消化,而對照組的細胞結(jié)構(gòu)完整,細胞中未見損傷細胞器,亦未見有自噬泡的形成。將GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HBE細胞后,共聚焦顯微鏡下可觀察到PM2.5干預組細胞質(zhì)中可見多個明亮的綠色熒光斑點,將mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞后,可觀察到PM2.5干預組細胞質(zhì)中可見很多明亮的紅色和黃色熒光斑點,分別代表了自噬溶酶體和自噬體,進一步證實PM2.5能夠誘導細胞自噬的發(fā)生。同時,也發(fā)現(xiàn)PM2.550μg/ml干預24小時后,NCI-H292細胞IL-8的表達顯著升高,而用細胞自噬相關基因Atg5-siRNA、Atg12-siRNA和Belinl-siRNA及細胞自噬抑制劑下調(diào)細胞自噬水平時,PM2.5誘導的IL-8的表達明顯減少。 體內(nèi)實驗中,利用PM2.5(2mg/ml連續(xù)氣道滴注2天的方法構(gòu)建小鼠氣道炎癥模型,通過對PM2.5干預組與NS干預組的對比發(fā)現(xiàn),PM2.5干預組小鼠BALF中細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)增加,肺組織及BALF上清中小鼠中性粒細胞的趨化因子KC和MIP-2的表達升高,肺組織病理學檢查HE染色發(fā)現(xiàn)PM2.5組較NS組氣道周圍炎癥細胞的浸潤明顯增加,提示PM2.5能夠誘導小鼠氣道炎癥的發(fā)生。Beclinl+/-/PM2.5與WT/PM2.5組小鼠相比,BAFL中細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)有明顯減少,肺組織及BALF上清中中性粒細胞的趨化因子KC和MIP-2的表達亦下降,同時病理學檢查發(fā)現(xiàn)氣道周圍炎癥細胞的浸潤也明顯減少,提示Beclinl+/-小鼠對PM2.5誘導的氣道炎癥具有明顯保護作用。 結(jié)論：體外體內(nèi)實驗證明細胞自噬在PM2.5誘導的氣道上皮細胞中性粒細胞趨化因子的表達增加和氣道炎癥的發(fā)生中起惡化作用,為治療PM2.5誘導的氣道炎癥提供治療靶點。
【關鍵詞】：PM2.5 細胞自噬 氣道炎癥 中性粒細胞 中性粒細胞趨化因子
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R562
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 縮略語中英文對照13-14
• 目次14-16
• 第一章 引言16-18
• 第二章 材料與方法18-34
• 2.1 PM18
• 2.2 實驗動物18
• 2.3 使用的主要實驗儀器與設備18-19
• 2.4 實驗試劑與材料19-22
• 2.4.1 實驗試劑與材料19-21
• 2.4.2 實驗試劑配制21-22
• 2.5 實驗方法22-34
• 2.5.1 細胞培養(yǎng)22
• 2.5.2 siRNA轉(zhuǎn)染(按Genmute siRNA transfection reagent說明書要求)22-23
• 2.5.3 細胞總mRNA的提取及組織總mRNA的提取23-24
• 2.5.4 cDNA的合成及Q-PCR過程24-26
• 2.5.5 構(gòu)建PM誘導的小鼠急性氣道炎癥模型26-27
• 2.5.6 動物處理及標本收集27
• 2.5.7 ELISA檢測BALF上清中KC/MIP-2的表達(RD ELISA試劑盒)27-28
• 2.5.8 透射電鏡樣品的準備及處理28-29
• 2.5.9 Western Blot29-31
• 2.5.10 GFP-LC3和mRFP-GFP-LC轉(zhuǎn)染及免疫熒光樣品準備31-32
• 2.5.11 統(tǒng)計學分析32-34
• 第三章 研究結(jié)果34-48
• 3.1 PM能夠誘導人氣道上皮細胞細胞自噬的發(fā)生34-38
• 3.1.1 不同濃度、不同時間PM干預HBE細胞,可誘導LC3B表達增加34-35
• 3.1.2 透射電鏡下觀察PM能夠誘導細胞自噬體形成35-36
• 3.1.3 GFP-LC3和mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HBE細胞觀察PM誘導細胞自噬的發(fā)生.36-38
• 3.2 細胞自噬在PM上調(diào)人氣道上皮細胞IL-8表達中的作用38-43
• 3.2.1 PM干預使人氣道上皮細胞IL-8 mRNA水平表達升高38-39
• 3.2.2 細胞自噬在PM上調(diào)人氣道上皮細胞IL-8中的作用39-43
• 3.3 Beclin1+/-小鼠對PM引起的急性氣道炎癥具有保護作用43-48
• 3.3.1 Beclin1+/_小鼠PM引起的氣道炎癥中中性粒細胞浸潤減少43-44
• 3.3.2 Beclin1+/-小鼠抑制PM上調(diào)的中性粒細胞趨化因子的表達44-45
• 3.3.3 Beclin1+/-小鼠對PM引起的急性氣道炎癥肺組織病理學檢查的影響45-48
• 第四章 討論48-52
• 第五章 結(jié)論52-54
• 參考文獻54-58
• 綜述58-68
• 參考文獻63-68
• 作者筒歷及在讀期間所取得的科研成果68-69

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6 楊鍵;鄧玉杰;張曉燕;呂鵬飛;徐俊;楊穎;寧光;;脂肪細胞自噬檢測方法的建立及意義探討[A];中華醫(yī)學會糖尿病學分會第十六次全國學術(shù)會議論文集[C];2012年

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