本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞自噬在PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：越來越多的研究發(fā)現(xiàn),懸浮顆粒物(particulate matters,PM)是引起呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病及癌癥發(fā)病率上升和死亡率增加的重要因素之一。PM主要由工業(yè)生產(chǎn)過程高溫產(chǎn)生或是生物燃料及礦物燃料燃燒所產(chǎn)生,通過沉積于氣道或者進(jìn)入肺泡,能引起或者加重多種肺部疾病。PM按空氣動(dòng)力學(xué)直徑(AD)可分為粗顆粒物(AD2.5pμm)、細(xì)顆粒物(0.1μm≤AD≤2.5μm)和超細(xì)顆粒物(AD0.1μm)。PM2.5即AD≤2.5pμm的懸浮顆粒物。當(dāng)顆粒物的粒徑越小,表面積越大時(shí),顆粒沉降速度越慢,傳播距離越遠(yuǎn),而且能攜帶更多的有毒有害物質(zhì),對(duì)人體健康的危害也越大。研究發(fā)現(xiàn)PM暴露可誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)性,誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞性氣道炎癥；可加重哮喘氣道炎癥,尤其是中性粒細(xì)胞性氣道炎癥,導(dǎo)致哮喘患者對(duì)激素治療敏感性降低,還可通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平從而誘導(dǎo)氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,亦可使哮喘患者更易發(fā)生氣道重塑。 細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)的重要過程,以滿足細(xì)胞代謝、細(xì)胞與組織更新、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的需要。正常生理?xiàng)l件下,細(xì)胞內(nèi)保持一個(gè)低的基礎(chǔ)自噬水平,但是當(dāng)細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)能量缺乏、氧化應(yīng)激、感染等情況下,自噬水平會(huì)迅速被上調(diào)。細(xì)胞自噬分3種類型,巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。通常說的細(xì)胞自噬即巨自噬。在細(xì)胞巨自噬過程中,來源于細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體或高爾基體的雙層膜結(jié)構(gòu)可通過包裹可溶性蛋白及某些細(xì)胞器形成自噬體,繼而與溶酶體融合形成自噬溶酶體,包裹物在溶酶體釋放的大量酸性蛋白酶的作用下得以降解和循環(huán)再利用。越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞自噬及與之相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白能夠影響細(xì)胞內(nèi)很多極其重要的生理過程如細(xì)胞增殖、程序性細(xì)胞死亡、炎癥及細(xì)胞免疫功能等,因此在包括神經(jīng)性疾病、心血管疾病、炎癥性疾病和腫瘤等在內(nèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。目前已有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬與呼吸系統(tǒng)疾病亦有關(guān)聯(lián)。細(xì)胞自噬在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷、呼吸道感染、肺動(dòng)脈高壓、肺囊性纖維化、α1-胰蛋白酶缺陷、敗血癥中發(fā)揮重要作用。 另有研究證實(shí)PM暴露能夠誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞自噬的發(fā)生,PM亦能夠引起中性粒細(xì)胞增高為主的氣道炎癥,而細(xì)胞自噬能調(diào)控急慢性氣道炎癥,提示細(xì)胞自噬也可能參與調(diào)控PM引起的氣道炎癥,目前尚未對(duì)此有報(bào)道。本課題擬以空氣動(dòng)力學(xué)直徑2.5μm的懸浮顆粒物PM2.5作為研究對(duì)象,研究細(xì)胞自噬在PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥中的作用。 目的：體外研究利用細(xì)胞自噬相關(guān)基因siRNA和抑制劑,體內(nèi)研究利用細(xì)胞自噬缺陷小鼠明確細(xì)胞自噬是否在PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥中發(fā)揮作用。 方法：體外研究中,首先用PM2.5干預(yù)人氣道上皮細(xì)胞HBE細(xì)胞,Western blot檢測(cè)LC3B的表達(dá),電鏡觀察自噬特征性結(jié)構(gòu)來觀察PM2.5是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,利用GFP-LC3和1RFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)入細(xì)胞后免疫熒光方法檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果,同時(shí)觀察PM2.5能否上調(diào)中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8的表達(dá)。然后,利用自噬相關(guān)基因siRNA特異性敲除自噬相關(guān)基因,利用自噬抑制劑下調(diào)細(xì)胞自噬水平后,觀察是否能夠影響PM2.5上調(diào)IL_8的表達(dá)。 體內(nèi)研究中,6-8周齡小鼠隨機(jī)分成4組：WT/NS組、Beclin1+/-/NS、WT/PM2.5和Beclin1+/-/PM2.5組,WT/PM2.5和Beclin1+/-/PM2.5組PM2.5短期氣道滴注構(gòu)建小鼠氣道炎癥模型,WT/NS組、Beclin1+/-/NS組等量生理鹽水氣道滴注作為對(duì)照,觀察各組小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)、分類細(xì)胞計(jì)數(shù)、病理學(xué)改變,采用ELISA方法檢測(cè)BALF上清中小鼠中性粒細(xì)胞趨化因子KC和MIP-2的表達(dá),Q-PCR檢測(cè)肺組織勻漿中KC和MIP-2的表達(dá)。 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)中,PM2.5100μg/ml干預(yù)24小時(shí)后,HBE細(xì)胞LC3B表達(dá)明顯增加。在透射電鏡下可見細(xì)胞內(nèi)黑色顆粒物周圍出現(xiàn)空泡狀雙層膜樣結(jié)構(gòu),正在或者已經(jīng)形成自噬體,并與溶酶體融合、消化,而對(duì)照組的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞中未見損傷細(xì)胞器,亦未見有自噬泡的形成。將GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HBE細(xì)胞后,共聚焦顯微鏡下可觀察到PM2.5干預(yù)組細(xì)胞質(zhì)中可見多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn),將mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后,可觀察到PM2.5干預(yù)組細(xì)胞質(zhì)中可見很多明亮的紅色和黃色熒光斑點(diǎn),分別代表了自噬溶酶體和自噬體,進(jìn)一步證實(shí)PM2.5能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。同時(shí),也發(fā)現(xiàn)PM2.550μg/ml干預(yù)24小時(shí)后,NCI-H292細(xì)胞IL-8的表達(dá)顯著升高,而用細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5-siRNA、Atg12-siRNA和Belinl-siRNA及細(xì)胞自噬抑制劑下調(diào)細(xì)胞自噬水平時(shí),PM2.5誘導(dǎo)的IL-8的表達(dá)明顯減少。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,利用PM2.5(2mg/ml連續(xù)氣道滴注2天的方法構(gòu)建小鼠氣道炎癥模型,通過對(duì)PM2.5干預(yù)組與NS干預(yù)組的對(duì)比發(fā)現(xiàn),PM2.5干預(yù)組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)增加,肺組織及BALF上清中小鼠中性粒細(xì)胞的趨化因子KC和MIP-2的表達(dá)升高,肺組織病理學(xué)檢查HE染色發(fā)現(xiàn)PM2.5組較NS組氣道周圍炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯增加,提示PM2.5能夠誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥的發(fā)生。Beclinl+/-/PM2.5與WT/PM2.5組小鼠相比,BAFL中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)有明顯減少,肺組織及BALF上清中中性粒細(xì)胞的趨化因子KC和MIP-2的表達(dá)亦下降,同時(shí)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)氣道周圍炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)也明顯減少,提示Beclinl+/-小鼠對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥具有明顯保護(hù)作用。 結(jié)論：體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞自噬在PM2.5誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞中性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá)增加和氣道炎癥的發(fā)生中起惡化作用,為治療PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥提供治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：PM2.5 細(xì)胞自噬 氣道炎癥 中性粒細(xì)胞 中性粒細(xì)胞趨化因子
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R562
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 縮略語中英文對(duì)照13-14
• 目次14-16
• 第一章 引言16-18
• 第二章 材料與方法18-34
• 2.1 PM18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18
• 2.3 使用的主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備18-19
• 2.4 實(shí)驗(yàn)試劑與材料19-22
• 2.4.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料19-21
• 2.4.2 實(shí)驗(yàn)試劑配制21-22
• 2.5 實(shí)驗(yàn)方法22-34
• 2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)22
• 2.5.2 siRNA轉(zhuǎn)染(按Genmute siRNA transfection reagent說明書要求)22-23
• 2.5.3 細(xì)胞總mRNA的提取及組織總mRNA的提取23-24
• 2.5.4 cDNA的合成及Q-PCR過程24-26
• 2.5.5 構(gòu)建PM誘導(dǎo)的小鼠急性氣道炎癥模型26-27
• 2.5.6 動(dòng)物處理及標(biāo)本收集27
• 2.5.7 ELISA檢測(cè)BALF上清中KC/MIP-2的表達(dá)(RD ELISA試劑盒)27-28
• 2.5.8 透射電鏡樣品的準(zhǔn)備及處理28-29
• 2.5.9 Western Blot29-31
• 2.5.10 GFP-LC3和mRFP-GFP-LC轉(zhuǎn)染及免疫熒光樣品準(zhǔn)備31-32
• 2.5.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32-34
• 第三章 研究結(jié)果34-48
• 3.1 PM能夠誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞細(xì)胞自噬的發(fā)生34-38
• 3.1.1 不同濃度、不同時(shí)間PM干預(yù)HBE細(xì)胞,可誘導(dǎo)LC3B表達(dá)增加34-35
• 3.1.2 透射電鏡下觀察PM能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬體形成35-36
• 3.1.3 GFP-LC3和mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HBE細(xì)胞觀察PM誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生.36-38
• 3.2 細(xì)胞自噬在PM上調(diào)人氣道上皮細(xì)胞IL-8表達(dá)中的作用38-43
• 3.2.1 PM干預(yù)使人氣道上皮細(xì)胞IL-8 mRNA水平表達(dá)升高38-39
• 3.2.2 細(xì)胞自噬在PM上調(diào)人氣道上皮細(xì)胞IL-8中的作用39-43
• 3.3 Beclin1+/-小鼠對(duì)PM引起的急性氣道炎癥具有保護(hù)作用43-48
• 3.3.1 Beclin1+/_小鼠PM引起的氣道炎癥中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少43-44
• 3.3.2 Beclin1+/-小鼠抑制PM上調(diào)的中性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá)44-45
• 3.3.3 Beclin1+/-小鼠對(duì)PM引起的急性氣道炎癥肺組織病理學(xué)檢查的影響45-48
• 第四章 討論48-52
• 第五章 結(jié)論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 綜述58-68
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 作者筒歷及在讀期間所取得的科研成果68-69

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