發(fā)布時間：2023-06-01 22:38

　　2003年春季在我國廣東、北京等地人群中爆發(fā)了以高熱、寒戰(zhàn)、肌肉痛、干咳、呼吸困難、高度接觸性傳染為主要特點的傳染性疾病，隨后該疾病被正式命名為“嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(簡稱SARS)”。病因?qū)W研究表明，SARS的病因是一種新型冠狀病毒，世界衛(wèi)生組織將其命名為SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-associated coronavirus，SARS-CoV)。作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，目前對其遺傳學(xué)和復(fù)制、裝配機制等還所知甚少，因此開展此方面研究具有重要意義。 筆者參與了SARS病原的調(diào)查工作。為深入闡明北京地區(qū)流行的SARA-CoV的病原學(xué)特征，首先從SARS病人病料標(biāo)本中進(jìn)行病毒分離試驗。將SARS病人臨床標(biāo)本，如咽拭子、痰液和肺組織標(biāo)本接種Vero細(xì)胞，連續(xù)傳代后，可觀察到顯著的細(xì)胞病理改變(CPE)，表明可能標(biāo)本中可能存在病毒。電鏡觀察分離物培養(yǎng)上清負(fù)染樣本，，可見到形態(tài)與典型冠狀病毒外觀相似的病毒樣顆粒；用SARS病人康復(fù)期血清進(jìn)行的間接免疫熒光試驗，顯示分離物接種培養(yǎng)的細(xì)胞胞漿內(nèi)存在特異性熒光，證實培養(yǎng)物中存在與SARS-CoV相關(guān)的病毒抗原；提取分離物總RNA進(jìn)行RT-PCR...

【文章頁數(shù)】：135 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
原創(chuàng)性聲明
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摘要
ABSTRACT
第一章 SARS冠狀病毒分子生物學(xué)進(jìn)展
    一 SARS-CoV基因組學(xué)研究進(jìn)展
    二 SARS-CoV非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子生物學(xué)研究進(jìn)展
        1.2.1 SARS-CoV多聚蛋白的RNA加工酶類似物
        1.2.2 SARS-CoV特異蛋白酶
            1.2.2.1 SARS-CoV的PL2^pro酶
            1.2.2.2 SARS-CoV的3CL^pro蛋白酶
        1.2.3 SARS-CoV的其他非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)
    三 SARS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子生物學(xué)
        1.3.1 SARS-CoV S蛋白質(zhì)分子生物學(xué)
            1.3.1.1 S蛋白質(zhì)概述
            1.3.1.2 S蛋白質(zhì)受體結(jié)合功能與SARS-CoV的受體
            1.3.1.3 S蛋白質(zhì)與膜融合
            1.3.1.4 S蛋白質(zhì)分子免疫學(xué)和膜融合抑制肽
            1.3.1.5 S蛋白質(zhì)其他細(xì)胞生理效應(yīng)
        1.3.2 SARS-CoV N蛋白質(zhì)分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)
            1.3.2.1 SARS-CoV N蛋白質(zhì)分子生物學(xué)
            1.3.2.2 SARS-CoV N蛋白質(zhì)分子免疫學(xué)
        1.3.3 SARS-CoV E蛋白質(zhì)和M蛋白質(zhì)分子生物學(xué)
            1.3.3.1 SARS-CoV E蛋白質(zhì)分子生物學(xué)
            1.3.3.2 SARS-CoV M蛋白質(zhì)分子生物學(xué)
    四 抗SARS-CoV疫苗及抗病毒藥物研究
        1.4.1 SARS-CoV疫苗
            1.4.1.1 SARS-CoV滅活病毒疫苗
            1.4.1.2 SARS-CoV重組蛋白質(zhì)疫苗與SARS-CoV病毒感染抑制性肽
            1.4.1.3 SARS-CoV DNA疫苗
            1.4.1.4 SARS-CoV DNA免疫與SARS病毒蛋白質(zhì)疫苗聯(lián)合應(yīng)用
            1.4.1.5 SARS-CoV重組活載體疫苗
        1.4.2 干擾素和小分子治療藥物
            1.4.2.1 干擾素
            1.4.2.2 小分子治療藥物
    五 SARS-CoV動物感染試驗?zāi)Ｐ?br>    六 結(jié)語
    七 本章參考文獻(xiàn)
第二章 SARS冠狀病毒的分離培養(yǎng)和鑒定
    一、材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 病毒分離標(biāo)本和分離細(xì)胞
            2.1.2 試劑、載體、實驗儀器和實驗場所
        2.2 方法
            2.2.1 病毒的細(xì)胞分離培養(yǎng)
            2.2.2 細(xì)胞分離物的收獲
            2.2.3 病毒培養(yǎng)物鑒定
            2.2.4 套式RT-PCR鑒定SASR-CoV特異性病毒RNA
            2.2.5 特異性擴增片段的回收克隆和測序
            2.2.6 病毒的滴定
    二、結(jié)果
        1.病料接種培養(yǎng)的Vero細(xì)胞產(chǎn)生CPE現(xiàn)象
        2.電鏡觀察到感染細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在冠狀病毒樣粒子
        3.病料接種Vero培養(yǎng)細(xì)胞與SARS病人康復(fù)期血清特異性結(jié)合
        4.SARS-CoV病毒特異性核酸序列分析結(jié)果
        5.分離的SARS-CoV病毒滴度一時間變化關(guān)系
    三、討論
    四、小結(jié)
    五、參考文獻(xiàn)
第三章 SARS病人肺組織中SARS-COV全基因組CDNA克隆及序列分析
    一、材料與方法
        3.1 材料
            3.1.1 RNA模板
            3.1.2 克隆引物
            3.1.3 PCR儀、工具酶和其他分子生物學(xué)常用試劑
        3.2 方法
            3.2.1 RNA模板提取
            3.2.2 SARS-CoV-5#全基因組cDNA克隆
    二 結(jié)果
        1.目的片段的克隆和重組質(zhì)粒初步PCR鑒定
        2.SARS-CoV-5#全基因組cDNA克隆測序
    三、討論
    四、本章小結(jié)
    五、參考文獻(xiàn)
    六、本章附錄
        1 本章附表
        2.本章附錄鏈接地址
        3.SARS-CoV-5#測序結(jié)果
第四章 SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因的表達(dá)及其病毒樣顆粒的包裝試驗
    一 材料和方法
        4.1.1 材料
            4.1.1.1 細(xì)胞、毒株
            4.1.1.2 試劑和抗體
        4.1.2 方法
            4.1.2.1 末端重疊拼接PCR法.人工合成密碼子優(yōu)化SASR-CoV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)E基因
            4.1.2.2 末端重疊拼接PCR人工合成密碼子優(yōu)化SASR-CoV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)M基因
            4.1.2.3 完整M基因組裝和測序
            4.1.2.4 PCR方法在M基因C末端引入肽標(biāo)簽FLAG
            4.1.2.5 表達(dá)SARS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因重組桿狀病毒載體的構(gòu)建
            4.1.2.6 重組冠狀病毒的包裝和滴定
            4.1.2.7 感染重組桿狀病毒的細(xì)胞內(nèi)SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因表達(dá)的檢測
            4.1.2.8 重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞形成細(xì)胞內(nèi)SARS-CoV VLP
    二、結(jié)果
        1 優(yōu)化密碼子合成的M、E基因的鑒定
        2 含SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因桿狀病毒重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的構(gòu)建
        3 表達(dá)SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的重組桿狀病毒的獲得與鑒定
            1) 重組桿狀病毒基因組Bacmid的PCR鑒定
            2) 重組桿狀病毒基因組Bacmid細(xì)胞轉(zhuǎn)染包裝病毒
            3) 重組桿狀病毒表達(dá)SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的檢測
        4 SARS-CoV VLP的裝配
    三、討論
    四、本章小結(jié)
    五、參考文獻(xiàn)
    六、本章附錄
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致謝



本文編號：3827161