目的觀察三個針對人轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）的小發(fā)夾RNA（shRNA）真核表達(dá)質(zhì)粒（shRNA1、shRNA2、shRNA3）對人肺成纖維細(xì)胞TGF-β1基因表達(dá)的抑制作用,并篩選出其中抑制效應(yīng)最佳的質(zhì)粒。觀察抑制TGF-β1基因表達(dá)對人肺成纖維細(xì)胞生長的影響,并初步評價其應(yīng)用的安全性,為進(jìn)一步研究RNAi在肺纖維化基因治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法將構(gòu)建完成的三個針對人轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）的小發(fā)夾RNA（shRNA）真核表達(dá)質(zhì)粒（shRNA1、shRNA2、shRNA3）和對應(yīng)的陰性對照質(zhì)粒（Control組、Control2組、Control3）進(jìn)行酶切鑒定和DNA測序分析。在Lipofectamine2000介導(dǎo)下分別將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肺成纖維細(xì)胞,分組命名為shRNA1組、shRNA2組、shRNA3組、Control組、Control2組、Control3組并設(shè)立未轉(zhuǎn)染空白對照組。轉(zhuǎn)染48h后應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR檢測人肺成纖維細(xì)胞TGF-β1mRNA的表達(dá)水平和ELISA檢測細(xì)胞上清液中TGF-β1蛋白質(zhì)含量。轉(zhuǎn)染48h后在光鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并... 

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【學(xué)位級別】：碩士

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縮略詞
前言
第一部分 特異性人TGF-β1shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的篩選
    材料與方法
        一、主要儀器與材料
            1.主要儀器及設(shè)備
            2.主要試劑、培養(yǎng)基及耗材
            3.菌株、細(xì)胞株及質(zhì)粒
            4.常用試劑的配制方法
        二、技術(shù)路線
        三、實(shí)驗(yàn)方法
            1.檢測各個重組質(zhì)粒
            2.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的制備
            3.人肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
            4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            5.實(shí)時熒光定量PCR檢測TGF-β1的mRNA含量
            6.ELISA法測定細(xì)胞上清液中TGF-β1含量
    結(jié)果
        1.TGF-β1 shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        2.人肺成纖維細(xì)胞形態(tài)特征
        3.實(shí)時熒光定量PCR定量測定TGF-β1 mRNA結(jié)果
        4.ELISA法測人肺成纖維細(xì)胞上清液TGF-β1蛋白的結(jié)果
    討論
        一、基因治療肺纖維化靶點(diǎn)的選擇
            1.肺纖維化的流行病學(xué)概況及治療現(xiàn)狀
            2.肺纖維化病因?qū)W研究得到的線索
            3.基因靶向治療肺纖維化的立論依據(jù)
        二、RNAi效應(yīng)分析
            1.RNAi現(xiàn)象及RNAi技術(shù)
            2.RNAi技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用
            3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論
        三、實(shí)驗(yàn)方法的討論
            1.細(xì)胞株的選擇
            2.轉(zhuǎn)染方法的選擇
            3.轉(zhuǎn)染要點(diǎn)
            4.檢測時間位點(diǎn)的選擇
            5.RNA干擾效應(yīng)的檢測方法
    結(jié)論
第二部分 干擾TGF-β1表達(dá)后對人肺成纖維細(xì)胞生長影響
    一、人肺成纖維細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組形態(tài)學(xué)觀察
        1.材料與儀器
        2.方法
        3.鏡下觀察結(jié)果
    二、臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞死亡數(shù)目
        1.材料與儀器
        2.方法
        3.臺盼藍(lán)染色計數(shù)結(jié)果
    三、討論
    四、結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
綜述
在校期間論文發(fā)表情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]阿魏酸鈉對肺纖維化大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長因子β1信號通路分子mRNA表達(dá)的影響[J]. 穆茂,程德云,楊禮騰,方詢,聶莉,胡小波.  中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志. 2007(02)
[2]轉(zhuǎn)化生長因子-β1及其受體在肺纖維化中的作用[J]. 甘紅英,劉學(xué)軍.  國際呼吸雜志. 2006(11)
[3]轉(zhuǎn)化生長因子-β與肺纖維化[J]. 任鵬,吳秀珍,趙靜,王獻(xiàn)華.  中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志. 2006(06)
[4]肺纖維化細(xì)胞因子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 何燕,鄧國忠,高天.  中華創(chuàng)傷雜志. 2006(06)
[5]細(xì)胞因子與肺纖維化[J]. 韋小瑜,何云,程明亮.  西南軍醫(yī). 2006(02)
[6]RNA干擾對系統(tǒng)性硬化病皮膚成纖維細(xì)胞結(jié)締組織生長因子表達(dá)的影響[J]. 肖嶸,羅婧瑩,劉伏友,周英,李亞萍,周怡新,蘇玉文,文海泉,楊心潔.  中華皮膚科雜志. 2006(01)
[7]短發(fā)夾RNA介導(dǎo)RNA干擾的時間和劑量效應(yīng)研究[J]. 何國平,張思仲,王英成,肖翠英,馬用信,許文明,丁蘭,陶大昌,孫巖,陳玉娟.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2005(03)
[8]損傷氣道上皮組織轉(zhuǎn)化在氣道重塑中的作用[J]. 張敏,吳壯,徐軍.  醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報. 2004(11)
[9]丹參對實(shí)驗(yàn)性肺纖維化小鼠病理變化和轉(zhuǎn)化生長因子-β表達(dá)的影響[J]. 苗維納,董靜,劉紹唐,陳康.  中藥藥理與臨床. 2003(05)
[10]Smad蛋白家族與TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[J]. 楊力.  中國美容醫(yī)學(xué). 2001(06)



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