發(fā)布時間：2017-05-12 22:08

  本文關(guān)鍵詞：人羊膜上皮細胞凍存前后生物學(xué)特性比較及其對脂多糖致肺損傷干預(yù)作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 1、液氮深低溫保存人羊膜上皮細胞（human Amniotic Epithelial Cells，hAECs）是否會對其干細胞活性產(chǎn)生影響，相關(guān)報道較少見。本研究從細胞形態(tài)學(xué)、細胞生長狀況、細胞表面干細胞標志物及干細胞基因表達、細胞體外成骨細胞、成脂肪細胞多向誘導(dǎo)分化四個方面，來觀察hAECs凍存前后的生物學(xué)活性和干細胞特性，以研究液氮深低溫保存hAECs的可靠性。 2、膿毒血癥仍然是導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）最常見的原因，目前尚缺乏十分有效的治療手段。本研究通過檢測肺組織病理學(xué)切片、肺組織和血清中細胞因子的變化，來觀察hAECs對內(nèi)毒素性肺損傷的干預(yù)作用及其可能機制，以探討人羊膜上皮細胞治療急性肺損傷的可行性。 方法： 1、取健康產(chǎn)婦足月剖宮產(chǎn)后胎盤的羊膜組織，采用多次胰酶消化法獲取hAECs，培養(yǎng)過程中經(jīng)多次差別消化法逐步純化hAECs。調(diào)整純化的第2代（P2）細胞密度至5×106/mL，向細胞中緩慢加入新鮮配制的二甲基亞砜（DMSO）凍存液。將凍存管置于程序降溫儀中，待溫度降至-100℃后迅速移入液氮罐中保存。1個月后對細胞進行復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察凍存前后hAECs的形態(tài)變化及增殖情況；并用流式細胞分析儀檢測細胞表面標記物（CD29、CD73、CD166、CD44、CD90、HLA-ABC、CD34）；用RT-PCR法檢測Oct-4及Nanog干細胞基因表達；同時在體外誘導(dǎo)hAECs向脂肪細胞、成骨細胞分化。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差（x s）表示，采用獨立樣本t檢驗法分析兩組間的差異。 2、向新生SD大鼠腹腔內(nèi)注射大腸桿菌內(nèi)毒素溶液20μL/g(5mg/kg)，制備脂多糖致急性肺損傷的動物模型。造模后2h經(jīng)氣管滴入CM-Dil熒光標記好的P2代hAECs。動物隨機分組如下：（A）正常組（n=5）；（B）模型組（LPS）（n=5）：腹腔內(nèi)注射LPS5mg/kg；（C）細胞組（n=5）：腹腔內(nèi)注射LPS5mg/kg+氣管內(nèi)滴注hAECs（5×105個cells/40μL）；（D）對照組（n=5）：腹腔內(nèi)注射LPS5mg/kg+氣管內(nèi)滴注40μLPBS液。分別在輸注細胞24h、72h后，處死動物收取標本，每組每個時間點各5只大鼠。取肺組織標本固定，HE染色后觀察肺損傷程度，測量肺損傷病理評分、肺泡間隔的厚度，測量肺干濕比（D/W）。用ELISA免疫吸附法檢測肺組織丙二醛（MDA）濃度和超氧化物歧化酶（SOD）活性、同時檢測血清中白介素10（IL-10）和白介素6（IL-6）的濃度。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差（x s）表示，用單因素方差分析法分析組間差異。 結(jié)果： 1、hAECs凍存前后的形態(tài)學(xué)無明顯改變，均呈鋪路石樣膜狀生長。與凍存前細胞相比，凍存后hAECs傳代時所需的消化時間有所縮短（P0.05），但細胞活率、傳代時間、培養(yǎng)代數(shù)無明顯改變。凍存前后細胞生長曲線均呈S型，凍存后細胞與凍存前細胞的生長周期相比，細胞經(jīng)歷滯留期、對數(shù)期和平臺期的時間無明顯差異。 2、凍存后hAECs仍可以表達干細胞表面標記，CD73、CD29、CD166陽性率達90%以上，中度表達CD90、CD44，低表達I類白細胞抗原(HLA-ABC)，不表達造血干細胞標志CD34。RT-PCR法檢測Oct-4及Nanog基因表達均呈陽性。體外誘導(dǎo)后，凍存前后的hAECs均可向成骨細胞、成脂肪細胞分化。 3、腹腔內(nèi)注射LPS后，肺組織可見不同程度充血、血管內(nèi)皮損傷出血，部分肺泡萎陷不張，部分肺泡間隔增厚、破壞。模型組與正常組相比，肺損傷病理評分、肺泡間隔的厚度均有顯著增加（P0.01）、肺干濕比減低（P=0.04）。檢測肺組織和血清中的生化指標發(fā)現(xiàn)， MDA濃度有所升高伴SOD活性減低，模型組與正常組比較，兩者的變化都尚未達到統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。模型組血清中促炎癥因子IL-6水平逐漸升高，抗炎因子IL-10的水平逐漸減低，與正常組相比，IL-6水平24h為1.25±0.01（P=0.762），72h為1.61±0.29（P=0.006）；IL-10的水平24h為13.68±1.14（P=0.219），72h為12.49±0.40（P=0.005），兩種因子在血清中的濃度變化72h時差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。 4、輸入hAECs細胞后，細胞組與對照組相比，24h和72h時肺損傷評分、肺泡間隔厚度均有顯著降低（P0.01），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。細胞組中肺干濕比（D/W值）與對照組相比有所升高，24h時P=0.046，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，72h時P=0.366差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。細胞組氧化因子MDA的濃度在肺組織中逐漸減低，抗氧化因子SOD活性逐漸升高，與對照組對比，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。細胞組中促炎癥因子IL-6水平降低，抗炎因子IL-10水平升高，與對照組相比72h時P0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1、凍存后的hAECs除細胞貼壁性有所下降外，細胞形態(tài)、細胞生長周期、細胞表面干細胞標記及其多向分化的潛能均沒有改變，說明液氮深低溫保存不影響hAECs的生物學(xué)特性，可以成為保存hAECs的一個可靠方法。 2、氣管內(nèi)輸入hAECs后，肺組織損傷評分減少、肺泡間隔的厚度縮小，肺水腫減輕，說明可以hAECs可以減少炎性細胞的浸潤，減輕肺泡滲出，對內(nèi)毒素導(dǎo)致的ALI具有修復(fù)作用。 3、hAECs能夠通過減輕局部氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子的平衡，減輕炎癥反應(yīng)，保護受損組織，促進組織恢復(fù)
【關(guān)鍵詞】：羊膜上皮細胞 多能性 深低溫保存 脂多糖 急性肺損傷
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R563
【目錄】：

• 主要符號表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-17
• 第一部分 人羊膜上皮細胞凍存前后生物學(xué)特性的比較17-30
• 材料及方法17-23
• 1 實驗材料17-19
• 1.1 主要實驗器材17
• 1.2 主要實驗儀器17-18
• 1.3 主要實驗試劑18-19
• 1.4 實驗試劑濃度的配制19
• 2 實驗方法19-23
• 2.1 人羊膜上皮細胞的收集、培養(yǎng)19-20
• 2.2 人羊膜上皮細胞的傳代培養(yǎng)20
• 2.3 人羊膜上皮細胞的凍存20
• 2.4 人羊膜上皮細胞的復(fù)蘇20-21
• 2.5 細胞增殖動力學(xué)分析21
• 2.6 流式細胞學(xué)檢測細胞表面標志物21
• 2.7 人羊膜上皮細胞的鑒定21
• 2.8 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測干細胞相關(guān)基因表達21-23
• 2.9 向成脂肪細胞誘導(dǎo)分化23
• 2.10 向成骨細胞誘導(dǎo)分化23
• 結(jié)果23-27
• 1 人羊膜上皮細胞凍存前后的培養(yǎng)及擴增23-25
• 2 人羊膜上皮細胞凍存前后生物學(xué)性狀分析25-27
• 討論27-30
• 第二部分 人羊膜上皮細胞對脂多糖致肺損傷的干預(yù)研究30-41
• 材料及方法30-35
• 1 實驗材料30-31
• 2 實驗方法31-35
• 3 統(tǒng)計學(xué)處理35
• 結(jié)果35-38
• 1 人羊膜上皮細胞在肺內(nèi)的情況35
• 2 評價細胞輸入前后肺組織炎癥程度35-37
• 3 細胞輸入后肺組織中細胞因子水平檢測37
• 4 細胞輸入后血清中細胞因子水平檢測37-38
• 討論38-41
• 總結(jié)41-42
• 附圖42-49
• 參考文獻49-54
• 綜述54-64
• 參考文獻60-64
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果64-65
• 致謝65-66

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黃友章;沈建良;宮立眾;鄭培浩;劉毅;尹文杰;岑堅;王寧;趙德峰;;骨髓細胞液氮保存21-25年后的細胞活力體外研究[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2010年01期

  本文關(guān)鍵詞：人羊膜上皮細胞凍存前后生物學(xué)特性比較及其對脂多糖致肺損傷干預(yù)作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：360956