發(fā)布時(shí)間：2017-05-06 17:20

  本文關(guān)鍵詞：小鼠哮喘模型Rac1水平的改變及其與ILC2相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:通過建立小鼠哮喘模型,檢測Rac1在小鼠哮喘模型前后相關(guān)組織中表達(dá)水平的改變情況,并分析Rac1與2型固有淋巴細(xì)胞(ILC2)相關(guān)細(xì)胞因子如IL-5、IL-33、IL-13表達(dá)的關(guān)系,觀察其對氣道炎癥的影響,探討Rac1調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)類型和參與哮喘病理損傷的可能機(jī)制,為進(jìn)一步深入研究哮喘病的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ),拓展哮喘病臨床干預(yù)的新思路。方法:1.卵清蛋白(OVA)哮喘模型的建立:哮喘建模參照文獻(xiàn)并稍加改進(jìn),即實(shí)驗(yàn)組小鼠在第1d和第11d分別腹腔注射50μg OVA和10%氫氧化鋁佐劑,對照組注射相等量的生理鹽水(NS),第22d開始實(shí)驗(yàn)組各小鼠給予霧化吸入2%的OVA與生理鹽水的混合溶液,激發(fā)小鼠的I型超敏反應(yīng),1次1小時(shí),每天霧化1次、一連5d。同時(shí),正常組小鼠給予吸入相等的NS。2.Rac1抑制劑(EHT1864)干預(yù)試驗(yàn):在建模過程中,于霧化前三天連續(xù)給小鼠腹腔注射EHT1864,其他步驟同上述哮喘模型建立。EHT1864粉劑在使用前用生理鹽水溶解并充分混勻,用藥量為40mg\kg。3.定量-PCR檢測m RNA:取小鼠支氣管肺泡灌洗、外周血單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)離心獲得細(xì)胞沉淀;取左邊肺組織,充分剪碎研磨得到組織懸液。于上述細(xì)胞或組織懸液加入Trizol以裂解細(xì)胞并獲取總RNA,然后再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成c DNA。繼而做實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測Rac1及ILC2相關(guān)細(xì)胞因子(IL-5,IL-33和IL-13)m RNA的表達(dá)。4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn):取小鼠的支氣管肺泡灌洗液(BALF)或眼球外周血,經(jīng)離心后得到灌洗液上清和外周血血清,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測ILC2相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-5,IL-33和IL-13)蛋白表達(dá)水平。5.組織切片病理觀察:取小鼠右肺組織置于福爾馬林中經(jīng)固定、石蠟包埋等一系列過程制成切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察病理表現(xiàn)。6.熒光抗體染色:取小鼠支氣管置于福爾馬林中經(jīng)固定、石蠟包埋等一系列過程制作成石蠟切片,再用直接法進(jìn)行免疫熒光抗體染色,檢測支氣管中Rac1的表達(dá)情況。7.采用Graph Pad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析:對哮喘小鼠肺組織Rac1和細(xì)胞因子(IL-5,IL-33和IL-13)的表達(dá)水平進(jìn)行直線相關(guān)分析,組間均數(shù)比較采用兩樣本非配對T檢驗(yàn),相關(guān)性分析選用Pearson法,P0.05,表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,多組間的統(tǒng)計(jì)分析采用0ne-way ANOVA,P0.05,表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.通過哮喘模型制作過程對小鼠的觀察可見,哮喘組小鼠表現(xiàn)為煩躁不安,出現(xiàn)頻繁瘙癢的行為,同時(shí)還伴有呼吸加深加快、打噴嚏、大小便失禁、擤鼻等典型的哮喘表現(xiàn),而對照組無明顯異常表現(xiàn)。2.肺組織病理觀察結(jié)果:HE染色顯微鏡下可見,哮喘組小鼠肺泡間及周圍小血管出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞,如嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、氣道內(nèi)杯狀細(xì)胞肥大增生、血清總Ig E及OVA-Ig E含量均高于對照組。而對照組小鼠可見,肺組織氣道結(jié)構(gòu)清晰、氣管周圍無細(xì)胞浸潤、炎癥性改變不明顯。3.免疫熒光分析表明:哮喘模型小鼠Rac1的水平與正常小鼠相比顯著下降,EHT1864干預(yù)后,Rac1的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。4.定量RT-PCR分析結(jié)果:哮喘小鼠肺組織或肺泡灌洗液Rac1 m RNA表達(dá)水平均明顯低于正常對照組,使用EHT1864干預(yù)后,Rac1水平則進(jìn)一步降低。5.小鼠肺組織表達(dá)ILC2相關(guān)細(xì)胞因子的檢測:通過分析模型組與正常組目的基因m RNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示,哮喘小鼠肺組織的IL-5、IL-33和IL-13的水平與正常組小鼠相比均顯著增高;EHT1864處理組的IL-5、IL-33和IL-13的水平上調(diào)尤為顯著。此結(jié)果表明Rac1的降低與ILC2相關(guān)細(xì)胞因子水平的升高存在著緊密的聯(lián)系。6.ELISA檢測外周血上清IL-5、IL-33和IL-13蛋白表達(dá)水平的結(jié)果表明,哮喘模型組小鼠上述細(xì)胞因子水平均高于對照組。7.分析肺組織中Rac1與IL-5、IL-33和IL-13m RNA表達(dá)水平關(guān)系的相關(guān)性結(jié)果顯示,哮喘小鼠肺組織Rac1的m RNA水平與IL-5、IL-33和IL-13的m RNA水平均顯示明顯的負(fù)相關(guān)。結(jié)論:在哮喘小鼠,IL-5、IL-33和IL-13的m RNA和蛋白表達(dá)水平與對照組相比都顯著增高,同時(shí)Rac1的表達(dá)卻顯著下降。相關(guān)性分析表明Rac1和ILC2s相關(guān)細(xì)胞因子(IL-5,IL-33,IL-13)之間存在顯著地負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步證明Rac1在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用,在小鼠激發(fā)之前給予EHT1864干預(yù)后,隨著Rac1表達(dá)水平的進(jìn)一步下調(diào),導(dǎo)致ILC2s相關(guān)細(xì)胞因子水平明顯增高,同時(shí)小鼠的哮喘癥狀及肺組織組損傷加重。這些結(jié)果可以推測Rac1可以影響哮喘的發(fā)病過程,如果將Rac1的受體激動(dòng)劑用于哮喘病人,有可能會(huì)有效改善炎癥狀態(tài)。進(jìn)一步研究Rac1在哮喘中的作用,有利于了解哮喘的免疫機(jī)制,可以幫助我們找到預(yù)防和治療哮喘的新靶標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：哮喘 ILC2s Rac1 EHT1864 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R562.25;R-332
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 緒論13-24
• 1.1 哮喘與免疫失衡14-16
• 1.1.1 哮喘的發(fā)生14-15
• 1.1.2 IL-33參與哮喘的發(fā)生15-16
• 1.2 ILC2細(xì)胞16-18
• 1.2.1 ILC2細(xì)胞的特點(diǎn)與功能16-17
• 1.2.2 ILC2細(xì)胞與哮喘17-18
• 1.3 Rac118-21
• 1.3.1 Rac1的特點(diǎn)與功能18-19
• 1.3.2 Rac1與哮喘19-20
• 1.3.3 Rac1的抑制劑EHT186420-21
• 1.4 本實(shí)驗(yàn)的研究目的、方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及意義21-24
• 1.4.1 研究目的21-22
• 1.4.2 研究方法22
• 1.4.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)22-23
• 1.4.3.1 研究思路22
• 1.4.3.2 技術(shù)路線22-23
• 1.4.4 實(shí)驗(yàn)研究意義23-24
• 第二章 OVA哮喘模型的建立與鑒定24-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料24-26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24
• 2.1.2 主要試劑24-25
• 2.1.3 主要溶液配制25
• 2.1.4 主要儀器25-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-29
• 2.2.1 小鼠OVA哮喘模型的建立26
• 2.2.2 炎癥標(biāo)本采集操作步驟26-28
• 2.2.3 肺組織切片HE染色28
• 2.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測外周血上清中OVA特異性IgE和總IgE水平28-29
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-31
• 2.3.1 哮喘小鼠的表現(xiàn)29
• 2.3.2 小鼠肺組織切片病理改變29-30
• 2.3.3 小鼠血清OVA-IgE和總IgE30-31
• 2.4 討論31-32
• 第三章 哮喘小鼠Rac1以及ILC2相關(guān)細(xì)胞因子的檢測32-45
• 3.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料33-34
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器33
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和材料33-34
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)溶液配制34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-38
• 3.2.1 免疫熒光檢測支氣管Rac1表達(dá)34-35
• 3.2.2 各標(biāo)本總RNA的提取35
• 3.2.3 將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA35-36
• 3.2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成36-37
• 3.2.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測mRNA水平37
• 3.2.6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血漿和灌洗液上清IL-5、IL-13和IL-33蛋白水平37-38
• 3.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-43
• 3.3.1 支氣管Rac1免疫熒光蛋白表達(dá)水平38-39
• 3.3.2 肺組織、外周血、肺泡灌洗液中Rac1的mRNA表達(dá)39-40
• 3.3.3 哮喘模型組ILC2相關(guān)細(xì)胞因子水平的改變40-41
• 3.3.4 肺組織中Rac1與ILC2相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)性分析41-43
• 3.4 討論43-45
• 第四章 Rac1抑制劑EHT1864對ILC2s特征性細(xì)胞因子表達(dá)的影響45-54
• 4.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料46-47
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器46-47
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和材料47
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)溶液配制47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法47-48
• 4.2.1 抑制劑EHT1864在模型中的使用47
• 4.2.2 免疫熒光檢測支氣管Rac1表達(dá)47
• 4.2.3 肺泡灌洗液，小鼠眼球外周血的分離47-48
• 4.2.4 各標(biāo)本RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄，引物的設(shè)計(jì)與合成48
• 4.2.5 提取外周血中單個(gè)核細(xì)胞48
• 4.2.6 熒光定量PCR法檢測各個(gè)標(biāo)本各基因mRNA水平48
• 4.2.7 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測灌洗液上清，，血清中細(xì)胞因子蛋白水平48
• 4.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析48
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-52
• 4.3.1 小鼠支氣管免疫熒光Rac1抗體染色48-50
• 4.3.2 小鼠肺組織、外周血中Rac1 mRNA的改變50
• 4.3.3 小鼠肺組織HE染色50-51
• 4.3.4 小鼠肺組織中IL-33 mRNA水平以及血漿、肺泡灌洗液IL-33蛋白表達(dá)水平的改變51-52
• 4.4 討論52-54
• 第五章 主要結(jié)論與展望54-56
• 5.1 主要結(jié)論54
• 5.2 展望54-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 致謝63-65
• 攻讀碩士期間已發(fā)表與待發(fā)表的文章65-66
• 英文縮寫索引66-67
• 圖標(biāo)清單67

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