發(fā)布時間：2017-04-30 12:18

  本文關(guān)鍵詞：自噬的調(diào)控對大鼠矽肺纖維化影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的1本研究通過3-甲基腺嘌呤抑制自噬和雷帕霉素誘導(dǎo)自噬活動,觀察染塵不同時間大鼠肺組織HE染色和Masson染色,同時對肺組織中膠原纖維面積的測定和血清中細胞因子含量的測定,分析各階段矽肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程。2通過電鏡切片和肺組織內(nèi)蛋白水平的表達,觀察肺巨噬細胞(Alveolar macrophage,AM)自噬活動的強弱,分析細胞自噬與矽肺纖維化的關(guān)系。3純化細胞灌洗液中的肺巨噬細胞,測其早期凋亡率,分析細胞自噬與細胞凋亡兩者的聯(lián)系。方法120只SPF級健康雄性Wistar大鼠隨機分為三組:模型組、三甲基腺嘌呤組(3-methlyadenine,3-MA)組和雷帕霉素組,每組均為40只。各組大鼠按照支氣管灌注的方式進行矽肺常規(guī)造模。每組大鼠均在染塵第7天、14天、28天、60天和90天分別處死8只,收集左側(cè)肺組織灌洗液,提取肺巨噬細胞,運用流式細胞儀檢測肺巨噬細胞早期凋亡率;心臟取血,離心獲取血清,使用酶聯(lián)免疫法測定血清中細胞因子TNF-ɑ、TGF-β和IL-10的含量,觀察肺纖維化的發(fā)展進程;取100mg左右的左側(cè)肺組織,實時定量熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-time PCR)分析Ⅰ型和Ⅲ型前膠原m RNA表達水平;取適量肺組織勻漿、組織裂解液裂解后,運用免疫印跡法測定肺組織內(nèi)LC3、Beclin1、AKT和PDK1的蛋白表達水平;取120mg左右的肺組織,按照試劑盒說明測定其羥脯氨酸含量;將黃豆粒大小的右側(cè)肺組織放入多聚甲醛溶液,行肺組織的HE染色和Masson染色,觀察各實驗組大鼠肺組織的病理變化情況和組織內(nèi)膠原纖維的變化情況,并運用IPP(Image Pro Plus)圖像分析軟件測定膠原纖維的面積;取粟粒大小肺組織經(jīng)2.5%的戊二醛溶液固定,制作電鏡切片,觀察肺巨噬細胞自噬活動的強弱程度。結(jié)果1各實驗組大鼠肺組織HE染色:模型組大鼠肺組織內(nèi)有炎性細胞浸潤,肺泡壁明顯增厚,肺泡腔減小,肺組織中成纖維細胞增多,隨著染塵時間肺組織內(nèi)出現(xiàn)大量的細胞結(jié)節(jié)和典型的矽結(jié)節(jié);3-MA組大鼠在染塵早期肺組織的炎癥反應(yīng)不明顯,但肺組織內(nèi)仍有少量的炎性細胞浸潤,在染塵后期大鼠肺組織內(nèi)有細胞結(jié)節(jié)但沒有明顯的矽結(jié)節(jié);雷帕霉素組大鼠在染塵初期的炎性反應(yīng)程度比模型組嚴重,染塵中期出現(xiàn)大量的成纖維細胞,并且有典型的矽結(jié)節(jié),染塵后期肺組織纖維化程度嚴重,肺組織被完全破壞。2各實驗組大鼠肺組織Masson染色:Masson染色觀察肺組織中膠原纖維的變化情況,運用形態(tài)學定量分析系統(tǒng)對膠原面積測定,發(fā)現(xiàn)模型組大鼠膠原纖維面積隨著染塵時間呈現(xiàn)上升趨勢;3-MA組大鼠膠原纖維面積在7天和14天增加,28天和60天膠原纖維面積與7天、14天比較,有減少的趨勢,90天時膠原面積再次升高。3-MA組與模型組各時期相比,膠原纖維面積均比模型組低;雷帕霉素組不同時期膠原面積在不斷增加,與模型組比較,膠原面積比模型組多,兩個實驗組與模型組比較均有統(tǒng)計學差異(P0.05)。各組羥脯氨酸的變化趨勢與本組膠原纖維面積的變化趨勢是相一致的。3不同處理組不同時期大鼠肺組織細胞Ⅰ、Ⅲ型前膠原m RNA測定:染塵后模型組7天Ⅰ型膠原m RNA比較高,14天和28天Ⅰ型膠原m RNA降低,60天和90天Ⅰ型膠原m RNA再次升高;3-MA組Ⅰ型膠原m RNA變化趨勢基本與模型組一致,只7天3-MA組Ⅰ型膠原m RNA比模型組高,其他時期均比模型組低;雷帕霉素組Ⅰ型膠原m RNA呈現(xiàn)升高-降低循環(huán)出現(xiàn)的變化趨勢,只染塵60天Ⅰ型膠原m RNA比模型組低,其他各時期均比模型組高。模型組Ⅲ型前膠原m RNA只染塵28天降低,其他各時期呈現(xiàn)升高趨勢;3-MA組在給藥初期Ⅲ型前膠原m RNA比較高,給藥期14天和28天以及停藥后60天的Ⅲ型前膠原m RNA呈現(xiàn)下降趨勢,停藥后90天的Ⅲ型前膠原m RNA再次升高,且3-MA組各時期Ⅲ型前膠原m RNA均比模型組低;雷帕霉素Ⅲ型前膠原m RNA的變化情況與本組Ⅰ型膠原m RNA的變化趨勢相一致,只7天和28天Ⅲ型前膠原m RNA比模型組高,其他各時期均比模型組低,兩組Ⅰ、Ⅲ型前膠原m RNA與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4各組血清中細胞因子含量的變化情況:模型組中細胞因子TNF-a含量隨著染塵時間呈上升趨勢;3-MA組細胞因子TNF-a含量在給藥第7天比較低,14天時含量增加,28天及停藥60天時含量降低,90天時含量再次升高,但各時期細胞因子含量均比模型組低;雷帕霉素組在給藥時期含量呈現(xiàn)上升趨勢,停藥后的60天含量明顯下降,90天時再次升高。各組TGF-β含量的變化趨勢與本組TNF-a相一致。而三組肺組織內(nèi)IL-10含量隨著染塵時間均呈現(xiàn)上升趨勢,雷帕霉素組各時期比模型組低,3-MA組各時期比模型組高。5各組大鼠肺巨噬細胞不同時期自噬活動:電鏡觀察發(fā)現(xiàn)不同處理組不同時期自噬活動強弱不同。模型組大鼠在染塵早期出現(xiàn)自噬前體和自噬溶酶體,染塵中期出現(xiàn)自噬體,染塵后期自噬體逐漸消失,3-MA組大鼠肺巨噬細胞中的自噬體比模型組數(shù)量少而雷帕霉素組自噬體的數(shù)量明顯比模型組多。為了進一步說明自噬活動的強弱,我們測定了自噬的的標志蛋白LC3和Beclin1,發(fā)現(xiàn)7天時3-MA組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值比模型組高但比雷帕霉素組低;而在14天和28天3-MA組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低且比模型組和雷帕霉素組低;停藥后3-MA組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值再次增高且60天時比模型組高,90天三個實驗組組數(shù)據(jù)差異沒有統(tǒng)計學意義;雷帕霉素組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值呈升高趨勢,且雷帕霉素組各個時期的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均比模型組高。各組Beclin1的蛋白表達與本組LC3的變化趨勢一致。6各組大鼠肺組織內(nèi)蛋白表達水平分析:本文通過western blotting的方法測定AKT和PDK1蛋白在肺組織中的表達水平,表示大鼠肺纖維化程度。實驗結(jié)果顯示模型組大鼠肺組織隨著染塵時間AKT蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢;3-MA組和雷帕霉素組大鼠肺組織中AKT蛋白含量隨著染塵時間同樣呈現(xiàn)上升趨勢,所不同的是3-MA組各個時期蛋白含量均比模型組低而雷帕霉素組各時期蛋白含量均比模型組高,且兩組與模型組的比較均有統(tǒng)計學差異。7肺巨噬細胞早期凋亡率測定:雷帕霉素組大鼠染塵不同時間LC3蛋白表達均增加且比模型組高;肺巨噬細胞早期凋亡率分別為(1.74±0.73)、(1.25±0.35)、(1.44±1.24)、(3.70±1.51)、(36.98±11.91)與模型組(5.63±1.01)、(4.95±0.63)、(4.10±0.43)、(6.75±4.19)、(30.23±11.05)相比,除90天外均比模型組低(P0.05);而3-MA組肺巨噬細胞的早期凋亡率分別為(2.86±1.13)、(8.80±0.28)、(6.84±1.29)、(2.54±1.65)、(37.22±16.22),7天時凋亡率低于其他時期;14天和28天時凋亡率增加且比同時期模型組高(P0.05);60天時凋亡率再次降低;90天凋亡率時與模型組無明顯差異。結(jié)論1雷帕霉素通過誘導(dǎo)自噬活動,導(dǎo)致染塵大鼠肺組織纖維化程度加重,且受自噬的調(diào)控,蛋白AKT、PDK1隨著染塵時間呈現(xiàn)上升趨勢。2 3-MA通過抑制自噬活動,導(dǎo)致染塵大鼠肺組織纖維化程度減輕,蛋白AKT、PDK1隨著染塵時間也呈現(xiàn)上升趨勢,但含量均比正常矽肺模型組大鼠的含量低。3雷帕霉素和3-MA誘導(dǎo)和抑制自噬活動后,在染塵初期,大鼠細胞早期凋亡率隨著自噬活動的增強而降低,但在染塵后期,細胞早期凋亡率隨著自噬活動增強也呈現(xiàn)升高的趨勢。
【關(guān)鍵詞】：肺巨噬細胞 自噬 肺纖維化 3-甲基腺嘌呤 雷帕霉素
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R135.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-15
• 引言15-17
• 第1章 實驗研究17-48
• 1.1 實驗動物17
• 1.1.1 動物分組17
• 1.1.2 矽肺造模17
• 1.1.3 藥物干預(yù)17
• 1.2 實驗試劑與儀器17-22
• 1.2.1 主要儀器17-19
• 1.2.2 主要試劑19-21
• 1.2.3 主要試劑配制21-22
• 1.3 研究內(nèi)容22
• 1.4 實驗方法22-28
• 1.4.1 肺組織的病理觀察22
• 1.4.2 肺組織Masson染色22-23
• 1.4.3 電鏡觀察23
• 1.4.4 Real-time PCR法檢測Ⅰ型和Ⅲ型前膠原23-24
• 1.4.5 肺組織纖維化和自噬相關(guān)蛋白含量測定24-27
• 1.4.6 羥脯氨酸含量測定27
• 1.4.7 細胞因子測定27-28
• 1.4.8 肺巨噬細胞早期凋亡率測定28
• 1.5 統(tǒng)計分析28
• 1.6 質(zhì)量控制28
• 1.7 結(jié)果28-39
• 1.7.1 大鼠肺組織纖維化程度的變化29-34
• 1.7.2 大鼠肺組織肺巨噬細胞自噬活動34-36
• 1.7.3 肺巨噬細胞早期凋亡水平36-38
• 1.7.4 調(diào)控自噬相關(guān)蛋白表達38-39
• 1.8 討論39-43
• 1.9 小結(jié)43-44
• 參考文獻44-48
• 第2章 綜述48-57
• 2.1 自噬48-50
• 2.1.1 自噬的基本概念48
• 2.1.2 自噬的形態(tài)特征48-49
• 2.1.3 自噬的分類49
• 2.1.4 自噬的發(fā)生機制49-50
• 2.1.5 自噬的生物學功能50
• 2.2 自噬的研究現(xiàn)狀50-52
• 2.2.1 自噬與肺部疾病50-51
• 2.2.2 自噬與其他疾病51-52
• 2.3 結(jié)語52
• 參考文獻52-57
• 結(jié)論57-58
• 致謝58-59
• 導(dǎo)師簡介59-60
• 作者簡介60-61
• 學位論文數(shù)據(jù)集61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王耀勇,徐啟勇,葉燕青,葉旭軍,龍翔;IL-10在博萊霉素誘導(dǎo)大鼠所致肺纖維化中的作用[J];武漢大學學報(醫(yī)學版);2004年02期

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本文編號：336857