第一部分浙江省788例COVID-19患者的臨床特征及SARS-Co V-2生物信息學分析背景:新型冠狀病毒感染疾�。–OVID-19）患者數(shù)量的快速增長給中國帶來沉重的公共衛(wèi)生負擔,并引起全世界的警惕。本研究主要分析浙江省的788例患者,確定其臨床特征與SARS-Co V-2（ZJ01）基因特征。方法:回顧性收集并分析了從2020年1月17日到2020年2月12日COVID-19確診患者資料,包括流行病學資料、人口學資料、臨床特征、實驗室檢查及治療數(shù)據(jù)等。其次是使用多因素logistic回歸模型來探索重型/危重型患者的獨立預測因子及浙江省SARS-Co V-2特征的生物信息學分析。結(jié)果:788例COVID-19患者的中位年齡為46.00（35.00-56.00）歲,潛伏期的中位數(shù)為5.00（2.00-9.00）天。高血壓、糖尿病和慢性肝病是最常見的基礎(chǔ)疾病。393（49.87%）例患者有武漢暴露史,195（24.75%）例患者為聚集性病例。78（9.90%）例患者為重型/危重型。發(fā)熱和咳嗽是最常見的癥狀,而88（11.17%）例患者有胃腸道癥狀。234（29.70%）的患者有白細胞減... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：177 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

SARS-Co V-2家族內(nèi)部可能出現(xiàn)潛在的進化分支。

序列分析結(jié)果表明ZJ01相較于SARS-CoV-2家族其它成員存在38處突變點(圖1-3.A)。其中35處突變點是ZJ01完全獨有的。另外3處中,20號突變點是由于測序錯誤導致,14號和38號突變點為SARS-CoV-2家族中廣泛存在的突變點。而在35處ZJ01完全獨有的突變點中,有7處刪除,4處插入,24處替換。其中共有10處(NO.22-31)位于S蛋白上。而在這10處中,有3處是同義突變,2處刪除突變,5處錯義突變。這些突變造成了S蛋白上Ser596,Gln613,Glu702,Ala771,Ala1015,Pro1053和Thr1066的變化。而對S蛋白的基因相似度分析結(jié)果表明,不同病毒家族之間的差別主要在S蛋白中S1的受體結(jié)合域(Receptor-binding domain,RBD)上。這一結(jié)構(gòu)負責細胞靶點的識別。而ZJ01和SARS-CoV-2病毒家族其它成員之間的差別主要在S2區(qū)域。(圖1-3.B)3.5.4同源建模與APBS分析結(jié)果表明ZJ01在F1、2位點附近的突變可能對Furin的結(jié)合造成影響

Furin是一種重要的絲氨酸蛋白酶,在流感病毒的致病過程中起著重要作用。禽流感病毒株Furin結(jié)合力的改變可能影響它的致病力[14]。雖然Furin在冠狀病毒家族中并不是最常見的蛋白水解酶,但是先前的研究已發(fā)現(xiàn)它在SARS、MERS中都起著重要作用[15,16]。ProP 1.0可以對氨基酸序列上的潛在Furin位點進行預測。通過ProP 1.0我們發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2病毒的S蛋白存在3處潛在的Furin位點(F1-3)。其中F1位于S1/S2上,F2位于S2段的S’位點上,F3位于S1的N段結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain,NTD)上(圖1-4.A)。進一步比對分析發(fā)現(xiàn)潛在Furin酶切位點在冠狀病毒進化中存在明確的進化順序和規(guī)律(圖1-4.B)。同源建模結(jié)果提示清晰顯示F1-3在SARS-Co V-2的S蛋白上所處的位置(圖1-4.C)。從空間位置上看,F1-3均位于S蛋白的表面并向外凸起,是良好的底物位點。F3位于S1-NTD的頂部側(cè)面。NTD起著促進病毒和細胞表面粘附的作用。而F1位于S蛋白中部,S1和S2中間的交接區(qū)域(S1/S2),呈現(xiàn)明顯的向外隆起。S1/S2區(qū)域的水解可將S1和S2分離,促進病毒與包膜融合侵入細胞。F2位于S2蛋白的中下部中間位置,這一部位的水解可能在進入細胞后參與致病機制。而GZ02,RaTG13,Wuhan-Hu-1和ZJ01的S蛋白同源建模結(jié)構(gòu)比對結(jié)果提示,在F1位點4中病毒株的蛋白空間結(jié)構(gòu)差異很大。從SARS到Ra TG13再到SARS-CoV-2,他們的F1位點呈現(xiàn)逐漸向外隆起的趨勢(圖1-4.D)。而盡管Wuhan-Hu-1和ZJ01在F1上的氨基酸序列是相同的,但是ZJ01在F1位點附近的突變(Glu702 to Lys702)依舊可能造成二者在蛋白空間構(gòu)象上的變化。這使得ZJ01的F1位點相較Wuhan-Hu-1進一步向外延伸11.6?。在F2位點上,RaTG13,Wuhan-Hu-1和ZJ01呈現(xiàn)高度的一致性,這與基因比對結(jié)果相一致。而GZ02與SARS-CoV-2相關(guān)病毒最大的不同在于,它的F2位點被深深包裹在S蛋白內(nèi)部,而SARS-CoV-2相關(guān)病毒則位于S蛋白的表面。盡管如此,先前的研究已經(jīng)證實S蛋白的S2’(F2)位點具有Furin活性[16]。這可能是F1位點被水解后,S1和S2分離,并使得原來包裹在蛋白內(nèi)部的F2位點得以暴露。Ra TG13,Wuhan-Hu-1和ZJ01在F3位點上也表現(xiàn)出高度的相似,而GZ02并不具有這一位點。APBS(Adaptive Poisson-Boltzmann Solver)是一種用來計算蛋白水溶液中表面靜電分布的經(jīng)典方法[17].通過對同源建模的Furin蛋白的APBS分析,我們發(fā)現(xiàn)Furin是一個整體帶負電荷的蛋白酶。在它的地位結(jié)合位點(191–192,253–258,292–295)周圍覆蓋著大量的負電荷(圖1-5)。Furin的這種電荷表現(xiàn)表明它可能對帶正電荷的底物有更好的結(jié)合力。對同源建模的S蛋白的APBS分析結(jié)果表明,SARS-CoV-2相關(guān)病毒(ZJ01、Wuhan-Hu-1、RaTG13)的F1位點上主要覆蓋正電荷,而SARS正負電荷混雜。與Wuhan-Hu-1相比,盡管ZJ01的F1位點的正電荷頭部更加向外突出,但F1基部卻有更多的負電荷。這種變化最終對ZJ01和Furin的結(jié)合力影響效果還仍未可知。GZ02的F2表面覆蓋著負電荷,而Wuhan-Hu-1和Ra TG13則以無電荷和少量正電荷為主。ZJ01相比這三者在F2區(qū)域呈現(xiàn)大量的正電荷�？紤]到在F2上ZJ01和Wuhan-Hu-1、Ra TG13的蛋白序列基空間結(jié)構(gòu)相近,這種電荷的劇烈變化可能是由于ZJ01在附近存在堿基刪除突變所致(Ala771 to-)。而在F3上,GZ02覆蓋著大量的負電荷。SARS-CoV-2相關(guān)病毒(ZJ01、Wuhan-Hu-1、Ra TG13)則以少量正電荷為主,且他們之間的差異非常小。這一點與基因序列比對結(jié)果相一致。由此我們可知,ZJ01雖然和Wuhan-Hu-1的基因序列高度一致,但是其在Furin酶切位點附近的突變造成了二者在蛋白結(jié)構(gòu)和表面靜電勢上的差異。這些差異可能會影響他們與Furin的實際結(jié)合能力。Furin整體呈負電荷,尤其是底物結(jié)合口袋(substrate binding pocket)內(nèi)部覆蓋了極強的負電荷。對GZ02、ZJ01、Wuhan-Hu-1、Ra TG13的F1-3位點的APBS分析結(jié)果提示他們在這3個位點上的靜電勢能存在巨大差異。這種差異的根源是他們在F1-3位點極其周圍的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)變化。ZJ01在F1-2位點周圍的突變很可能造成它和Wuhan-Hu-1在這兩個位點上的Furin結(jié)合力差異。

【參考文獻】：
期刊論文
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