目的:預(yù)測(cè)、篩選肺炎嗜衣原體（Chlamydophila pneumoniae,Cpn）III型分泌系統(tǒng)（Type III secretion system,T3SS）效應(yīng)蛋白編碼基因,并研究其免疫活性,探討預(yù)測(cè)的T3SS效應(yīng)蛋白重組蛋白在臨床Cpn血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法:①通過(guò)生物信息學(xué)分析結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,預(yù)測(cè)Cpn T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因;②以Cpn AR39菌株總RNA為模板,RT-PCR從轉(zhuǎn)錄水平分析Cpn T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因在感染細(xì)胞的表達(dá)情況,并篩選出在感染后72小時(shí)有表達(dá)的基因;③PCR擴(kuò)增預(yù)測(cè)Cpn T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因,將其亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-2中構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/目的片段,經(jīng)PCR、測(cè)序鑒定后將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。采用SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物;對(duì)溫度、IPTG和時(shí)間等誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行系列的優(yōu)化后,獲得可溶性表達(dá)蛋白并大量誘導(dǎo)表達(dá)。GST純化樹脂純化重組蛋白,用tris8.0將目的蛋白透析降低谷胱甘肽濃度,BCA法測(cè)定蛋白濃度;用重組蛋白包被... 

【文章來(lái)源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

預(yù)測(cè)基因的RT-PCR分析·Fig1.RT-PCRanalysisofpredictedgenes

圖 2：PCR 產(chǎn)物 1%瓊脂糖電泳分析Fig 2. Electrophoretic analysis of PCR product in 1% agarose gel..1.Cpn1022； 2.Cpn0962； 3.Cpn0423； 4.Cpn0710； 5.Cpn0422；6.Cpn0322; 7.Cpn0704； 8.Cpn0810； 9.Cpn0425； 10.Cpn0960；11.Cpn04314. 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定4.1 核苷酸序列分析 Blast 分析：將重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，BLAST 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與 GenBank 上登錄的編碼序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明擴(kuò)增的 11 個(gè)目的基因序列與登錄號(hào)為 GenBank 上基因完全一致，無(wú)一堿基突變，且密碼子讀碼框架正確。列舉 Cpn0960 測(cè)序結(jié)果及分析結(jié)果

Query 77 GVFDCRPLIRQELLLESDCFEECSGQGCPERKNILKFLEDRKKHEGNSPFEYL 129GVFDCRPLIRQELLLESDCFEECSGQGCPERKNILKFLEDRKKHEGN+PFEYLSbjct 61 GVFDCRPLIRQELLLESDCFEECSGQGCPERKNILKFLEDRKKHEGNNPFEYL 1135.pGEX6p-2/目的基因重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定5．1 pGEX6p-2/目的基因重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 E.coli Bl21 表達(dá)宿主菌，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE 結(jié)果顯示：誘導(dǎo)菌在相應(yīng)位置處有明顯條帶，與預(yù)期的分子量相符（圖 3）。


本文編號(hào)：3318500