目的:預測、篩選肺炎嗜衣原體（Chlamydophila pneumoniae,Cpn）III型分泌系統(tǒng)（Type III secretion system,T3SS）效應蛋白編碼基因,并研究其免疫活性,探討預測的T3SS效應蛋白重組蛋白在臨床Cpn血清學診斷中的應用價值。方法:①通過生物信息學分析結(jié)合相關文獻報道,預測Cpn T3SS效應蛋白編碼基因;②以Cpn AR39菌株總RNA為模板,RT-PCR從轉(zhuǎn)錄水平分析Cpn T3SS效應蛋白編碼基因在感染細胞的表達情況,并篩選出在感染后72小時有表達的基因;③PCR擴增預測Cpn T3SS效應蛋白編碼基因,將其亞克隆至原核表達載體pGEX-6P-2中構建重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/目的片段,經(jīng)PCR、測序鑒定后將其轉(zhuǎn)化至表達宿主菌E.coli BL21中,IPTG誘導表達。采用SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定表達產(chǎn)物;對溫度、IPTG和時間等誘導表達條件進行系列的優(yōu)化后,獲得可溶性表達蛋白并大量誘導表達。GST純化樹脂純化重組蛋白,用tris8.0將目的蛋白透析降低谷胱甘肽濃度,BCA法測定蛋白濃度;用重組蛋白包被... 

【文章來源】：南華大學湖南省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

預測基因的RT-PCR分析·Fig1.RT-PCRanalysisofpredictedgenes

圖 2：PCR 產(chǎn)物 1%瓊脂糖電泳分析Fig 2. Electrophoretic analysis of PCR product in 1% agarose gel..1.Cpn1022； 2.Cpn0962； 3.Cpn0423； 4.Cpn0710； 5.Cpn0422；6.Cpn0322; 7.Cpn0704； 8.Cpn0810； 9.Cpn0425； 10.Cpn0960；11.Cpn04314. 原核表達載體的構建及鑒定4.1 核苷酸序列分析 Blast 分析：將重組質(zhì)粒進行序列測定，BLAST 軟件對測序結(jié)果與 GenBank 上登錄的編碼序列進行比對，結(jié)果表明擴增的 11 個目的基因序列與登錄號為 GenBank 上基因完全一致，無一堿基突變，且密碼子讀碼框架正確。列舉 Cpn0960 測序結(jié)果及分析結(jié)果

Query 77 GVFDCRPLIRQELLLESDCFEECSGQGCPERKNILKFLEDRKKHEGNSPFEYL 129GVFDCRPLIRQELLLESDCFEECSGQGCPERKNILKFLEDRKKHEGN+PFEYLSbjct 61 GVFDCRPLIRQELLLESDCFEECSGQGCPERKNILKFLEDRKKHEGNNPFEYL 1135.pGEX6p-2/目的基因重組質(zhì)粒的誘導表達與鑒定5．1 pGEX6p-2/目的基因重組質(zhì)粒的誘導表達將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 E.coli Bl21 表達宿主菌，進行誘導表達。SDS-PAGE 結(jié)果顯示：誘導菌在相應位置處有明顯條帶，與預期的分子量相符（圖 3）。


本文編號：3318500