本文關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮生長因子通過PI3K和JNK通路破壞氣道上皮的屏障功能，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及意義： 支氣管哮喘(簡稱哮喘)是最常見的慢性呼吸道炎癥性疾病之一,研究顯示,全球哮喘病人約3億多,我國約有3000萬,而且仍有不斷增加的趨勢。盡管通過全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)推薦的規(guī)范化治療,大部分哮喘病人的臨床癥狀可得到有效控制,但并不能抑制疾病潛在的發(fā)展,因此探討哮喘的發(fā)病機制,進一步尋找治療靶點具有重要的意義。 氣道上皮細(xì)胞(AEC)作為氣道抵御外來環(huán)境刺激的第一道防線,在維持氣道內(nèi)環(huán)境的平衡和穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用,在哮喘氣道炎癥的啟動和維持中扮演關(guān)鍵角色。雖然支氣管哮喘是以TH-2型炎癥為主的氣道慢性炎癥炎癥性疾病,但哮喘患者對外界過敏原刺激的高度敏感性及其疾病的進程卻不能單純用TH-2等免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥的來解釋,而近年來越來越多的研究表明氣道上皮細(xì)胞等結(jié)構(gòu)細(xì)胞可以感受外界的有害刺激,并在啟動和維持哮喘炎癥過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明：哮喘患者存在氣道上皮屏障功能受損,即氣道上皮細(xì)胞連接蛋白的表達量減少或分布異常。繼上皮細(xì)胞屏障功能被屋塵螨、花粉、真菌等過敏原破壞后,通過上皮細(xì)胞分泌各種炎性因子及過敏原穿過受損的上皮屏障與上皮下DC等免疫細(xì)胞接觸等過程,共同激活免疫細(xì)胞而促發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng),與此同時,氣道上皮細(xì)胞還分泌許多細(xì)胞因子促進粘液分泌、基底膜增厚、平滑肌細(xì)胞增生等誘導(dǎo)氣道重塑,從而引起更強更持久的慢性炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致哮喘病程過程的不可逆轉(zhuǎn)。 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)家族主要包括VEGF-A、B、C、D、E、F,其中研究最多的是VEGF-A,人VEGF-A基因由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成,其mRNA以不同方式剪切形成5種同分異構(gòu)體(VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206)。多數(shù)情況下,VEGF165的表達占優(yōu)勢,是發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要成分。國內(nèi)外研究中的VEGF,若未特殊說明,均指VEGF165。VEGF的功能復(fù)雜,它能促血管生成、增加血管的通透性及血管重塑,也可促進受損組織修復(fù)及保護組織細(xì)胞。 國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)相對于正常人,哮喘患者的誘導(dǎo)痰和支氣管肺泡灌洗液中VEGF濃度明顯升高,并且其升高水平與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。之后的動物研究發(fā)現(xiàn)干擾VEGF作用后,TDI-哮喘小鼠的哮喘癥狀及氣道炎癥明顯緩解。而相對于正常小鼠,過表達VEGF的小鼠出現(xiàn)了明顯的哮喘樣癥狀。這些動物實驗提示VEGF在哮喘發(fā)病過程有重要作用。進一步的研究表明VEGF通過活化氣道上皮下的DC參與到Th2細(xì)胞炎癥中,同時它還可誘發(fā)粘膜化生,氣道重塑及氣道高反應(yīng)性等。這些研究進一步證實了VEGF在支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性作用,而這一作用很可能是通過調(diào)控氣道炎癥介導(dǎo)的。此外,有研究表明VEGF介導(dǎo)了蟑螂提取物、花粉等常見過敏原誘導(dǎo)的氣道上皮屏障破壞,我們實驗室既往研究也表明：在體外試驗中, TDI-HSA復(fù)合物或屋塵螨可引起氣道上皮細(xì)胞系(16HBE)或人氣道原代上皮細(xì)胞通透性的增加,該通透性的改變與VEGF的釋放有關(guān)。但VEGF是否可直接破壞氣道屏障功能及氣道上皮細(xì)胞間連接蛋白,進而啟動和促發(fā)氣道炎癥目前尚不清楚。 糖皮質(zhì)激素成為哮喘治療的一線藥物,是由于其強大的抗炎作用,糖皮質(zhì)激素可以減輕炎癥細(xì)胞浸潤及抑制多種炎癥因子的表達,例如,它可以通過作用于氣道上皮細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素受體,抑制氣道上皮細(xì)胞釋放多種炎癥因子,近期研究亦表明糖皮質(zhì)激素可通過EGFR受體途徑作用氣道上皮細(xì)胞,引起正常狀態(tài)下氣道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1等重新分布,有增強上皮間屏障功能的作用。但是在損傷狀態(tài)下,糖皮質(zhì)激素是否具有上皮屏障修復(fù)作用尚不清楚。因此探討致敏狀態(tài)或損傷狀態(tài)下,糖皮質(zhì)激素對氣道上皮細(xì)胞屏障功能的保護作用非常重要和必要,這可能為糖皮質(zhì)激素運用于哮喘治療提供新的證據(jù),同時為哮喘的治療找到新的治療靶點。 本研究擬在體外實驗證明重組人VEGF165對呼吸道上皮屏障功能的影響,進一步探討糖皮質(zhì)激素在其中的干預(yù)作用及可能的作用機制。 課題第一部分：血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE-14o和人肺腺癌細(xì)胞株A549屏障功能的影響 研究方法： 1、四唑鹽(MTT)比色法檢測不同濃度的VEGF對16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)活力的影響。分組情況：正常對照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF10ng/ml、VEGF50ng/ml、VEGF100ng/ml、VEGF150ng/ml(n=8)。按上述分組刺激細(xì)胞24h后,用MTT比色法檢測細(xì)胞活力。 2、觀察VEGF50ng/ml在不同時間點對16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)屏障功能的影響。分組情況：正常對照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF30分鐘組,VEGF2小時組,VEGF6小時組,VEGF12小時組,VEGF24小時組(n=6)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行細(xì)胞跨膜電阻測定及FITC-右旋糖酐檢測細(xì)胞層的通透性。 3、觀察VEGF50ng/ml在不同時間點對16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin、claudin-2)和粘附連接蛋白(E-Cadherin、p-Catenin)表達的影響。分組情況：正常對照組(不加VEGF165只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF30分鐘組,VEGF2小時組,VEGF6小時組,VEGF12小時組,VEGF24小時組(n=8)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行Western blot檢測ZO-1、E-Cadherin等蛋白總的表達水平。 4、觀察VEGF50ng/ml對16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)粘附連接蛋白(E-Cadherin、β-Catenin)分布的影響。分組情況：正常對照組(不加VEGF165只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF6小時組(n=4)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行免疫熒光檢測E-Cadherin、β-Catenin蛋白的分布情況。統(tǒng)計學(xué)方法： 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊時,總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采用Tamhane's T2檢驗,以P0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、不同濃度VEGF對16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)活力的影響：VEGF濃度為10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml時對細(xì)胞活力均無顯著影響(P=0.23)；VEGF濃度為150ng/ml時顯著抑制細(xì)胞活力(P0.05)。 2、VEGF50ng/ml在不同時間點對16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)屏障功能的影響：細(xì)胞跨膜電阻及FITC-右旋糖酐透過率顯示：相對于正常對照組,50ng/mlVEGF刺激16HBE細(xì)胞30分鐘、2小時、6小時、12小時、24小時均可顯著增加細(xì)胞層的通透性(P0.05),以50ng/mlVEGF刺激6小時細(xì)胞通透性增加最顯著(P0.01)；相對于正常對照組,50ng/mlVEGF刺激A549細(xì)胞30分鐘、2小時、6小時、12小時、24小時均可顯著增加細(xì)胞層的通透性(P0.05),并呈時間依賴,以50ng/mlVEGF刺激24小時細(xì)胞通透性增加最顯著(P0.01)。 3、VEGF50ng/ml在不同時間點對16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin、claudin-2)和粘附連接蛋白(E-Cadherin、β-Catenin)表達的影響：Western blot所見,各組ZO-1、Occludin、claudin-2、E-Cadherin、 β-Catenin總表達量無明顯改變(P0.05)。 4、VEGF50ng/ml對16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)粘附連接蛋白(E-Cadherin、 β-Catenin)分布的影響：免疫熒光顯示：在正常16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞),E-Cadherin和β-Catenin多沿胞膜連續(xù)分布于細(xì)胞間連接處,VEGF50ng/ml處理6小時后,細(xì)胞間連接處E-Cadherin和β-Catenin的完整性遭到破壞,向胞漿中彌散增多。 結(jié)論： 1、VEGF可顯著破壞16HBE細(xì)胞和A549細(xì)胞的屏障功能。 2、VEGF可顯著誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞和A549細(xì)胞E-鈣粘蛋白及p-環(huán)連蛋白分布的改變。但對E-鈣粘蛋白、p-環(huán)連蛋白、ZO-1、Occludin及claudin-2蛋白的總表達量無顯著影響。 課題第二部分：VEGF通過活化P13K通路和JNK通路破壞人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE-14o的屏障功能 研究方法： 1、觀察VEGF50ng/ml在不同時間點對16HBE細(xì)胞信號通路分子(P13K、JNK等)的活化。分組情況：正常對照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF5分鐘組,VEGF10分鐘組,VEGF15分鐘組,VEGF30分鐘小時組,VEGF1小時組,VEGF2小時組,VEGF6小時組(n=6)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行Western blot檢測PI3K、JNK等信號蛋白的總水平及磷酸化水平。 2、觀察P13K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對、VEGF活化的PI3K、JNK及Erk通路蛋白的影響。分組情況：正常對照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml30分鐘組,LY294002(或SP600125或U0126)預(yù)處理1小時后VEGF50ng/ml30分鐘組,LY294002(或SP600125或U0126)組(n=6)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行Western blotting檢測PI3K、JNK及Erk信號蛋白的總水平及磷酸化水平。 3、觀察PI3K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對VEGF所致氣道上皮屏障破壞的影響。分組情況：正常對照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml6小時組,LY294002(或SP600125或U0126)預(yù)處理1小時后VEGF50ng/ml6小時組,LY294002(或SP600125或U0126)組(n=4)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行細(xì)胞跨膜電阻測定及FITC-右旋糖酐檢測細(xì)胞層的通透性。 4、觀察P13K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對VEGF引起的E-Cadherin和β-Catenin蛋白破壞是否具有保護作用。分組情況：正常對照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml6小時組,LY294002(或SP600125或U0126)預(yù)處理1小時后VEGF50ng/ml6小時組,LY294002(或SP600125或U0126)組(n=4)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行免疫熒光檢測E-Cadherin、β-Catenin蛋白的分布情況。 5、統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊時,總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采用Tamhanes T2檢驗,以P0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、VEGF50ng/ml在不同時間點對16HBE細(xì)胞信號通路分子(PI3K、JNK等)的活化：Western blotting所見,相對于正常對照組,VEGF刺激16HBE15分鐘、30分鐘后,p-Akt、p-JNK及p-Erk蛋白表達顯著增加(P0.05)。 2、P13K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對VEGF活化的PI3K、JNK及Erk通路蛋白的影響：Western blotting所見,相對于VEGF組,LY294002(或SP600125或U0126)預(yù)處理后VEGF組的p-Akt(或p-JNK或p-Erk)蛋白表達顯著降低(P0.05)。 3、P13K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對VEGF所致氣道上皮屏障破壞的影響：細(xì)胞跨膜電阻及FITC-右旋糖酐透過率顯示：相對于VEGF處理組,LY294002(或SP600125)預(yù)處理后VEGF組的細(xì)胞屏障功能可部分恢復(fù)(P0.05),U0126預(yù)處理后VEGF組的細(xì)胞屏障功能無明顯改變(P0.05)。 4、P13K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對VEGF引起的E-Cadherin和β-Catenin蛋白破壞的影響：免疫熒光顯示,相對于VEGF處理組,LY294002(或SP600125)預(yù)處理后VEGF組E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白的分布及結(jié)構(gòu)改變可部分被逆轉(zhuǎn),U0126預(yù)處理后VEGF組E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白的分布及結(jié)構(gòu)改變無明顯差異。 結(jié)論： VEGF可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞株16HBE的PI3K、JNK及Erk信號通路活化。而PI3K或JNK通路抑制劑(LY294002或SP600125)可部分逆轉(zhuǎn)VEGF所致的VEGF所致的上皮細(xì)胞屏障功能的破壞和E-鈣粘蛋白、p-環(huán)連蛋白分布改變。這也提示VEGF可通過P13K和JNK信號通路調(diào)節(jié)E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白的分布,從而發(fā)揮破壞氣道上皮細(xì)胞屏障的作用。 課題第三部分：地塞米松通過PI3K通路減少VEGF所致的氣道上皮屏障破壞研究方法： 1、觀察地塞米松對VEGF引起的16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)屏障破壞是否有保護作用。分組情況：正常對照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml6小時組,地塞米松10-4M預(yù)處理后VEGF50ng/ml6小時組,地塞米松10-4M處理組(n=5)。上述分組刺激細(xì)胞后,行細(xì)胞跨膜電阻測定及FITC-右旋糖酐檢測細(xì)胞層的通透性。 2、觀察地塞米松對VEGF所致的E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白破壞是否有保護作用。分組情況：正常對照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml6小時組,地塞米松10-4M預(yù)處理后VEGF50ng/ml6小時組,地塞米松10-4M處理組(n=4)。上述分組刺激細(xì)胞后,行免疫熒光檢測E-Cadherin、β-Catenin蛋白的分布情況。 3、觀察地塞米松能否抑制VEGF誘導(dǎo)的PI3K(或JNK)活化。分組情況：正常對照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml6小時組,地塞米松10-4M預(yù)處理后VEGF50ng/ml6小時組,地塞米松10-4M處理組(n=7)。上述分組刺激細(xì)胞后,行Western blotting檢測PI3K、JNK蛋白的總水平及磷酸化水平。 4、統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊時,總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采用Tamhane's T2檢驗,以P0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、地塞米松對VEGF引起的16HBE細(xì)胞屏障破壞的影響：細(xì)胞跨膜電阻及FITC-右旋糖酐透過率顯示：相對于VEGF處理組,地塞米松預(yù)處理后VEGF組的上皮細(xì)胞屏障功能可部分恢復(fù)(P0.05),相對于正常對照組,地塞米松處理組的上皮細(xì)胞屏障功能無顯著改變(P0.05)。 2、地塞米松對VEGF所致的E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白破壞的影響：免疫熒光顯示,相對于VEGF處理組,地塞米松預(yù)處理后VEGF組的E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白分布減少、排列紊亂及向胞漿內(nèi)彌散等情況可部分恢復(fù)。 3、地塞米松對VEGF活化PI3K(或JNK)的影響：Western blotting所見,相對于VEGF處理組,地塞米松預(yù)處理后VEGF組的p-Akt蛋白表達顯著減少(P0.05),地塞米松預(yù)處理后VEGF組的p-JNK蛋白表達無明顯變化(P0.05)。 結(jié)論： 1、地塞米松可通過PI3K信號通路部分修復(fù)VEGF所致16HBE細(xì)胞的屏障破壞,這一效應(yīng)是通過恢復(fù)E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白的結(jié)構(gòu)完成的。 3、短時間內(nèi)地塞米松對16HBE細(xì)胞屏障功能無保護作用。
【關(guān)鍵詞】：支氣管哮喘 支氣管上皮細(xì)胞 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 地塞米松 E-鈣粘蛋白 β-環(huán)連蛋白 PI3K信號通路
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 技術(shù)路線圖21-23
• 前言23-28
• 第一章 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對人支氣管上皮細(xì)胞株16 HBE-14o和人肺腺癌細(xì)胞株A549屏障功能的影響28-42
• 1. 實驗材料28-35
• 2. 結(jié)果35-40
• 3. 討論40-42
• 第二章 VEGF通過活化PI3K通路和JNK通路破壞人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE-14o的屏障功能42-53
• 1. 實驗材料42-46
• 2. 結(jié)果46-52
• 3. 討論52-53
• 第三章 地塞米松通過PI3K通路減少VEGF所致的氣道上皮屏障破壞53-62
• 1. 實驗材料53-56
• 2. 結(jié)果56-60
• 3. 討論60-62
• 全文小結(jié)62-66
• 參考文獻66-71
• 中英文縮略詞對照表71-72
• 攻讀碩士期間主要成果72-73
• 致謝73-74

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 高元妹;夏e

本文編號：331072