發(fā)布時(shí)間：2017-04-27 17:21

  本文關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子通過PI3K和JNK通路破壞氣道上皮的屏障功能，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及意義： 支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是最常見的慢性呼吸道炎癥性疾病之一,研究顯示,全球哮喘病人約3億多,我國(guó)約有3000萬,而且仍有不斷增加的趨勢(shì)。盡管通過全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)推薦的規(guī)范化治療,大部分哮喘病人的臨床癥狀可得到有效控制,但并不能抑制疾病潛在的發(fā)展,因此探討哮喘的發(fā)病機(jī)制,進(jìn)一步尋找治療靶點(diǎn)具有重要的意義。 氣道上皮細(xì)胞(AEC)作為氣道抵御外來環(huán)境刺激的第一道防線,在維持氣道內(nèi)環(huán)境的平衡和穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用,在哮喘氣道炎癥的啟動(dòng)和維持中扮演關(guān)鍵角色。雖然支氣管哮喘是以TH-2型炎癥為主的氣道慢性炎癥炎癥性疾病,但哮喘患者對(duì)外界過敏原刺激的高度敏感性及其疾病的進(jìn)程卻不能單純用TH-2等免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥的來解釋,而近年來越來越多的研究表明氣道上皮細(xì)胞等結(jié)構(gòu)細(xì)胞可以感受外界的有害刺激,并在啟動(dòng)和維持哮喘炎癥過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明：哮喘患者存在氣道上皮屏障功能受損,即氣道上皮細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)量減少或分布異常。繼上皮細(xì)胞屏障功能被屋塵螨、花粉、真菌等過敏原破壞后,通過上皮細(xì)胞分泌各種炎性因子及過敏原穿過受損的上皮屏障與上皮下DC等免疫細(xì)胞接觸等過程,共同激活免疫細(xì)胞而促發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),與此同時(shí),氣道上皮細(xì)胞還分泌許多細(xì)胞因子促進(jìn)粘液分泌、基底膜增厚、平滑肌細(xì)胞增生等誘導(dǎo)氣道重塑,從而引起更強(qiáng)更持久的慢性炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致哮喘病程過程的不可逆轉(zhuǎn)。 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)家族主要包括VEGF-A、B、C、D、E、F,其中研究最多的是VEGF-A,人VEGF-A基因由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成,其mRNA以不同方式剪切形成5種同分異構(gòu)體(VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206)。多數(shù)情況下,VEGF165的表達(dá)占優(yōu)勢(shì),是發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要成分。國(guó)內(nèi)外研究中的VEGF,若未特殊說明,均指VEGF165。VEGF的功能復(fù)雜,它能促血管生成、增加血管的通透性及血管重塑,也可促進(jìn)受損組織修復(fù)及保護(hù)組織細(xì)胞。 國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常人,哮喘患者的誘導(dǎo)痰和支氣管肺泡灌洗液中VEGF濃度明顯升高,并且其升高水平與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。之后的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)干擾VEGF作用后,TDI-哮喘小鼠的哮喘癥狀及氣道炎癥明顯緩解。而相對(duì)于正常小鼠,過表達(dá)VEGF的小鼠出現(xiàn)了明顯的哮喘樣癥狀。這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示VEGF在哮喘發(fā)病過程有重要作用。進(jìn)一步的研究表明VEGF通過活化氣道上皮下的DC參與到Th2細(xì)胞炎癥中,同時(shí)它還可誘發(fā)粘膜化生,氣道重塑及氣道高反應(yīng)性等。這些研究進(jìn)一步證實(shí)了VEGF在支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性作用,而這一作用很可能是通過調(diào)控氣道炎癥介導(dǎo)的。此外,有研究表明VEGF介導(dǎo)了蟑螂提取物、花粉等常見過敏原誘導(dǎo)的氣道上皮屏障破壞,我們實(shí)驗(yàn)室既往研究也表明：在體外試驗(yàn)中, TDI-HSA復(fù)合物或屋塵螨可引起氣道上皮細(xì)胞系(16HBE)或人氣道原代上皮細(xì)胞通透性的增加,該通透性的改變與VEGF的釋放有關(guān)。但VEGF是否可直接破壞氣道屏障功能及氣道上皮細(xì)胞間連接蛋白,進(jìn)而啟動(dòng)和促發(fā)氣道炎癥目前尚不清楚。 糖皮質(zhì)激素成為哮喘治療的一線藥物,是由于其強(qiáng)大的抗炎作用,糖皮質(zhì)激素可以減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及抑制多種炎癥因子的表達(dá),例如,它可以通過作用于氣道上皮細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素受體,抑制氣道上皮細(xì)胞釋放多種炎癥因子,近期研究亦表明糖皮質(zhì)激素可通過EGFR受體途徑作用氣道上皮細(xì)胞,引起正常狀態(tài)下氣道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1等重新分布,有增強(qiáng)上皮間屏障功能的作用。但是在損傷狀態(tài)下,糖皮質(zhì)激素是否具有上皮屏障修復(fù)作用尚不清楚。因此探討致敏狀態(tài)或損傷狀態(tài)下,糖皮質(zhì)激素對(duì)氣道上皮細(xì)胞屏障功能的保護(hù)作用非常重要和必要,這可能為糖皮質(zhì)激素運(yùn)用于哮喘治療提供新的證據(jù),同時(shí)為哮喘的治療找到新的治療靶點(diǎn)。 本研究擬在體外實(shí)驗(yàn)證明重組人VEGF165對(duì)呼吸道上皮屏障功能的影響,進(jìn)一步探討糖皮質(zhì)激素在其中的干預(yù)作用及可能的作用機(jī)制。 課題第一部分：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE-14o和人肺腺癌細(xì)胞株A549屏障功能的影響 研究方法： 1、四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度的VEGF對(duì)16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)活力的影響。分組情況：正常對(duì)照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF10ng/ml、VEGF50ng/ml、VEGF100ng/ml、VEGF150ng/ml(n=8)。按上述分組刺激細(xì)胞24h后,用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力。 2、觀察VEGF50ng/ml在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)屏障功能的影響。分組情況：正常對(duì)照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF30分鐘組,VEGF2小時(shí)組,VEGF6小時(shí)組,VEGF12小時(shí)組,VEGF24小時(shí)組(n=6)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行細(xì)胞跨膜電阻測(cè)定及FITC-右旋糖酐檢測(cè)細(xì)胞層的通透性。 3、觀察VEGF50ng/ml在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin、claudin-2)和粘附連接蛋白(E-Cadherin、p-Catenin)表達(dá)的影響。分組情況：正常對(duì)照組(不加VEGF165只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF30分鐘組,VEGF2小時(shí)組,VEGF6小時(shí)組,VEGF12小時(shí)組,VEGF24小時(shí)組(n=8)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行Western blot檢測(cè)ZO-1、E-Cadherin等蛋白總的表達(dá)水平。 4、觀察VEGF50ng/ml對(duì)16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)粘附連接蛋白(E-Cadherin、β-Catenin)分布的影響。分組情況：正常對(duì)照組(不加VEGF165只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF6小時(shí)組(n=4)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行免疫熒光檢測(cè)E-Cadherin、β-Catenin蛋白的分布情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí)總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采用Tamhane's T2檢驗(yàn),以P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、不同濃度VEGF對(duì)16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)活力的影響：VEGF濃度為10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞活力均無顯著影響(P=0.23)；VEGF濃度為150ng/ml時(shí)顯著抑制細(xì)胞活力(P0.05)。 2、VEGF50ng/ml在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)屏障功能的影響：細(xì)胞跨膜電阻及FITC-右旋糖酐透過率顯示：相對(duì)于正常對(duì)照組,50ng/mlVEGF刺激16HBE細(xì)胞30分鐘、2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)均可顯著增加細(xì)胞層的通透性(P0.05),以50ng/mlVEGF刺激6小時(shí)細(xì)胞通透性增加最顯著(P0.01)；相對(duì)于正常對(duì)照組,50ng/mlVEGF刺激A549細(xì)胞30分鐘、2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)均可顯著增加細(xì)胞層的通透性(P0.05),并呈時(shí)間依賴,以50ng/mlVEGF刺激24小時(shí)細(xì)胞通透性增加最顯著(P0.01)。 3、VEGF50ng/ml在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin、claudin-2)和粘附連接蛋白(E-Cadherin、β-Catenin)表達(dá)的影響：Western blot所見,各組ZO-1、Occludin、claudin-2、E-Cadherin、 β-Catenin總表達(dá)量無明顯改變(P0.05)。 4、VEGF50ng/ml對(duì)16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)粘附連接蛋白(E-Cadherin、 β-Catenin)分布的影響：免疫熒光顯示：在正常16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞),E-Cadherin和β-Catenin多沿胞膜連續(xù)分布于細(xì)胞間連接處,VEGF50ng/ml處理6小時(shí)后,細(xì)胞間連接處E-Cadherin和β-Catenin的完整性遭到破壞,向胞漿中彌散增多。 結(jié)論： 1、VEGF可顯著破壞16HBE細(xì)胞和A549細(xì)胞的屏障功能。 2、VEGF可顯著誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞和A549細(xì)胞E-鈣粘蛋白及p-環(huán)連蛋白分布的改變。但對(duì)E-鈣粘蛋白、p-環(huán)連蛋白、ZO-1、Occludin及claudin-2蛋白的總表達(dá)量無顯著影響。 課題第二部分：VEGF通過活化P13K通路和JNK通路破壞人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE-14o的屏障功能 研究方法： 1、觀察VEGF50ng/ml在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)16HBE細(xì)胞信號(hào)通路分子(P13K、JNK等)的活化。分組情況：正常對(duì)照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF5分鐘組,VEGF10分鐘組,VEGF15分鐘組,VEGF30分鐘小時(shí)組,VEGF1小時(shí)組,VEGF2小時(shí)組,VEGF6小時(shí)組(n=6)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行Western blot檢測(cè)PI3K、JNK等信號(hào)蛋白的總水平及磷酸化水平。 2、觀察P13K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對(duì)、VEGF活化的PI3K、JNK及Erk通路蛋白的影響。分組情況：正常對(duì)照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml30分鐘組,LY294002(或SP600125或U0126)預(yù)處理1小時(shí)后VEGF50ng/ml30分鐘組,LY294002(或SP600125或U0126)組(n=6)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行Western blotting檢測(cè)PI3K、JNK及Erk信號(hào)蛋白的總水平及磷酸化水平。 3、觀察PI3K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對(duì)VEGF所致氣道上皮屏障破壞的影響。分組情況：正常對(duì)照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml6小時(shí)組,LY294002(或SP600125或U0126)預(yù)處理1小時(shí)后VEGF50ng/ml6小時(shí)組,LY294002(或SP600125或U0126)組(n=4)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行細(xì)胞跨膜電阻測(cè)定及FITC-右旋糖酐檢測(cè)細(xì)胞層的通透性。 4、觀察P13K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對(duì)VEGF引起的E-Cadherin和β-Catenin蛋白破壞是否具有保護(hù)作用。分組情況：正常對(duì)照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml6小時(shí)組,LY294002(或SP600125或U0126)預(yù)處理1小時(shí)后VEGF50ng/ml6小時(shí)組,LY294002(或SP600125或U0126)組(n=4)。按上述分組刺激細(xì)胞后,行免疫熒光檢測(cè)E-Cadherin、β-Catenin蛋白的分布情況。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí)總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采用Tamhanes T2檢驗(yàn),以P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、VEGF50ng/ml在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)16HBE細(xì)胞信號(hào)通路分子(PI3K、JNK等)的活化：Western blotting所見,相對(duì)于正常對(duì)照組,VEGF刺激16HBE15分鐘、30分鐘后,p-Akt、p-JNK及p-Erk蛋白表達(dá)顯著增加(P0.05)。 2、P13K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對(duì)VEGF活化的PI3K、JNK及Erk通路蛋白的影響：Western blotting所見,相對(duì)于VEGF組,LY294002(或SP600125或U0126)預(yù)處理后VEGF組的p-Akt(或p-JNK或p-Erk)蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05)。 3、P13K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對(duì)VEGF所致氣道上皮屏障破壞的影響：細(xì)胞跨膜電阻及FITC-右旋糖酐透過率顯示：相對(duì)于VEGF處理組,LY294002(或SP600125)預(yù)處理后VEGF組的細(xì)胞屏障功能可部分恢復(fù)(P0.05),U0126預(yù)處理后VEGF組的細(xì)胞屏障功能無明顯改變(P0.05)。 4、P13K(或JNK或Erk)通路抑制劑LY294002(或SP600125或U0126)對(duì)VEGF引起的E-Cadherin和β-Catenin蛋白破壞的影響：免疫熒光顯示,相對(duì)于VEGF處理組,LY294002(或SP600125)預(yù)處理后VEGF組E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白的分布及結(jié)構(gòu)改變可部分被逆轉(zhuǎn),U0126預(yù)處理后VEGF組E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白的分布及結(jié)構(gòu)改變無明顯差異。 結(jié)論： VEGF可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞株16HBE的PI3K、JNK及Erk信號(hào)通路活化。而PI3K或JNK通路抑制劑(LY294002或SP600125)可部分逆轉(zhuǎn)VEGF所致的VEGF所致的上皮細(xì)胞屏障功能的破壞和E-鈣粘蛋白、p-環(huán)連蛋白分布改變。這也提示VEGF可通過P13K和JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白的分布,從而發(fā)揮破壞氣道上皮細(xì)胞屏障的作用。 課題第三部分：地塞米松通過PI3K通路減少VEGF所致的氣道上皮屏障破壞研究方法： 1、觀察地塞米松對(duì)VEGF引起的16HBE細(xì)胞(或A549細(xì)胞)屏障破壞是否有保護(hù)作用。分組情況：正常對(duì)照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml6小時(shí)組,地塞米松10-4M預(yù)處理后VEGF50ng/ml6小時(shí)組,地塞米松10-4M處理組(n=5)。上述分組刺激細(xì)胞后,行細(xì)胞跨膜電阻測(cè)定及FITC-右旋糖酐檢測(cè)細(xì)胞層的通透性。 2、觀察地塞米松對(duì)VEGF所致的E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白破壞是否有保護(hù)作用。分組情況：正常對(duì)照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml6小時(shí)組,地塞米松10-4M預(yù)處理后VEGF50ng/ml6小時(shí)組,地塞米松10-4M處理組(n=4)。上述分組刺激細(xì)胞后,行免疫熒光檢測(cè)E-Cadherin、β-Catenin蛋白的分布情況。 3、觀察地塞米松能否抑制VEGF誘導(dǎo)的PI3K(或JNK)活化。分組情況：正常對(duì)照組(不加VEGF,只以無血清培養(yǎng)基孵育),VEGF50ng/ml6小時(shí)組,地塞米松10-4M預(yù)處理后VEGF50ng/ml6小時(shí)組,地塞米松10-4M處理組(n=7)。上述分組刺激細(xì)胞后,行Western blotting檢測(cè)PI3K、JNK蛋白的總水平及磷酸化水平。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí)總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采用Tamhane's T2檢驗(yàn),以P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、地塞米松對(duì)VEGF引起的16HBE細(xì)胞屏障破壞的影響：細(xì)胞跨膜電阻及FITC-右旋糖酐透過率顯示：相對(duì)于VEGF處理組,地塞米松預(yù)處理后VEGF組的上皮細(xì)胞屏障功能可部分恢復(fù)(P0.05),相對(duì)于正常對(duì)照組,地塞米松處理組的上皮細(xì)胞屏障功能無顯著改變(P0.05)。 2、地塞米松對(duì)VEGF所致的E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白破壞的影響：免疫熒光顯示,相對(duì)于VEGF處理組,地塞米松預(yù)處理后VEGF組的E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白分布減少、排列紊亂及向胞漿內(nèi)彌散等情況可部分恢復(fù)。 3、地塞米松對(duì)VEGF活化PI3K(或JNK)的影響：Western blotting所見,相對(duì)于VEGF處理組,地塞米松預(yù)處理后VEGF組的p-Akt蛋白表達(dá)顯著減少(P0.05),地塞米松預(yù)處理后VEGF組的p-JNK蛋白表達(dá)無明顯變化(P0.05)。 結(jié)論： 1、地塞米松可通過PI3K信號(hào)通路部分修復(fù)VEGF所致16HBE細(xì)胞的屏障破壞,這一效應(yīng)是通過恢復(fù)E-鈣粘蛋白和p-環(huán)連蛋白的結(jié)構(gòu)完成的。 3、短時(shí)間內(nèi)地塞米松對(duì)16HBE細(xì)胞屏障功能無保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：支氣管哮喘 支氣管上皮細(xì)胞 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) 地塞米松 E-鈣粘蛋白 β-環(huán)連蛋白 PI3K信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R562.25
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 技術(shù)路線圖21-23
• 前言23-28
• 第一章 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞株16 HBE-14o和人肺腺癌細(xì)胞株A549屏障功能的影響28-42
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料28-35
• 2. 結(jié)果35-40
• 3. 討論40-42
• 第二章 VEGF通過活化PI3K通路和JNK通路破壞人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE-14o的屏障功能42-53
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料42-46
• 2. 結(jié)果46-52
• 3. 討論52-53
• 第三章 地塞米松通過PI3K通路減少VEGF所致的氣道上皮屏障破壞53-62
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料53-56
• 2. 結(jié)果56-60
• 3. 討論60-62
• 全文小結(jié)62-66
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 中英文縮略詞對(duì)照表71-72
• 攻讀碩士期間主要成果72-73
• 致謝73-74

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 高元妹;夏e

本文編號(hào)：331072