本文關(guān)鍵詞：蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在香煙誘導(dǎo)肺纖維化中的調(diào)節(jié)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的：吸煙是引發(fā)慢性阻塞性肺部疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases, COPD)的主要危險(xiǎn)因素。香煙含有大量的氧化物質(zhì),這些氧化物能激活蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2(protein tyrosine phosphatase, Shp2)。Shp2是一種由PTPNII基因編碼的蛋白酪氨酸磷酸酶,含有2個(gè)SH結(jié)構(gòu)域,其作為細(xì)胞因子、生長因子及其他胞外刺激因素的下游信號(hào)分子廣泛地表達(dá)于機(jī)體各種組織和細(xì)胞中,參與細(xì)胞增殖、分化、死亡等諸多細(xì)胞生命活動(dòng)環(huán)節(jié)。我們之前研究證明吸煙和香煙煙霧提取物(Cigarette smoke extract,CSE)能夠激活人上皮細(xì)胞Shp2mRNA和蛋白的表達(dá),Shp2抑制劑干預(yù)和肺上皮細(xì)胞Shp2基因敲除小鼠或細(xì)胞可減輕吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)與上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)。本課題中我們探討抑制和基因敲除Shp2減輕吸煙誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的作用及機(jī)制。 方法： 1、整體實(shí)驗(yàn)：觀察Shp2特異性抑制劑PHPS1干預(yù)和肺上皮細(xì)胞Shp2基因敲除小鼠對(duì)吸煙引起的肺纖維化指標(biāo)的影響。小鼠每天吸煙10支,連續(xù)10天,誘導(dǎo)肺纖維化模型,檢測(cè)指標(biāo)包括轉(zhuǎn)錄生長因子β1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproleinase-9, MMP-9)、鈣結(jié)合蛋白(Calcium binding protein, S100A4),膠原纖維沉積以及Shp2表達(dá)。 1)收集肺泡灌洗液(BALF),采用酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)法檢測(cè)BALF上清中MMP-9和TGF-β1蛋白表達(dá)； 2)收集肺組織,制備勻漿上清液,采用定量多聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)法測(cè)定勻漿上清液中MMPs和TGF-β1基因的表達(dá)； 3)制作肺組織切片,采用免疫組化染色法檢測(cè)小氣道周圍Shp2、MMP-9和S100A4表達(dá)； 4)肺組織切片,采用Masson膠原纖維染色法檢測(cè)小氣道周圍膠原纖維沉積。 2、離體實(shí)驗(yàn)：觀察Shp2特異性抑制劑PHPS1處理肺上皮細(xì)胞和Shp2基因沉默肺上皮細(xì)胞對(duì)CSE誘導(dǎo)的MMP-9和TGF-β1表達(dá)的影響,以及對(duì)信號(hào)分子的影響。 香煙煙霧提取物(CSE)刺激小鼠正常肺上皮細(xì)胞MLE-12： 1)采用MTT法測(cè)定MLE-12細(xì)胞活性； 2) Western blot (WB)法檢測(cè)CSE誘導(dǎo)p-Shp2和Shp2表達(dá)； 3)CSE刺激MLE-12細(xì)胞,Q-PCR法檢測(cè)MMPs基因表達(dá),WB法檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá)； 4)Shp2特異性抑制劑PHPS1干預(yù)細(xì)胞后進(jìn)行CSE刺激,采用Q-PCR和WB法檢測(cè)Shp2對(duì)CSE誘導(dǎo)MMP-9基因和蛋白的影響； 5)Shp2siRNA沉默Shp2基因后進(jìn)行CSE刺激,采用WB法檢測(cè)Shp2對(duì)CSE誘導(dǎo)MMP-9的調(diào)節(jié)作用。 香煙煙霧提取物(CSE)刺激人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549： 6)CSE刺激A549細(xì)胞,半定量多聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Elisa法檢測(cè)TGF-β1基因和蛋白表達(dá)； 7)Shp2特異性抑制劑PHPS1干預(yù)A549細(xì)胞后進(jìn)行CSE刺激,采用Q-PCR法檢測(cè)Shp2對(duì)CSE誘導(dǎo)TGF-β1基因表達(dá)的影響； 8)作用機(jī)制研究：預(yù)先給予Erk1/2抑制劑U0126, JNK抑制劑SP600125,p38抑制劑SB203580阻斷Erk1/2, JNK和p38的活性,CSE刺激MLE-12細(xì)胞后,Q-PCR和WB法檢測(cè)CSE誘導(dǎo)MMP-9表達(dá),研究分析其可能的作用機(jī)制。 結(jié)果： 1、整體實(shí)驗(yàn)： 1)小鼠經(jīng)香煙煙霧暴露10天后,肺泡與小氣道上皮細(xì)胞的Shp2表達(dá)顯著增高； 2) BALF上清中MMP-9及TGF-β1的蛋白表達(dá)顯著性增強(qiáng)；肺組織中MMP-9和TGF-β1基因水平表達(dá)明顯升高；肺組織MMP-9、S100A4的表達(dá)量以及膠原纖維沉積明顯升高； 3)與對(duì)照組小鼠相比,煙霧暴露小鼠經(jīng)Shp2特異性抑制劑PHPS1干預(yù)后,BALF上清中MMP-9、TGF-β1的蛋白表達(dá)顯著性下降；肺組織勻漿MMP-9和TGF-β1的基因表達(dá)水平亦明顯降低,肺MMP-9、S100A4表達(dá)量以及膠原纖維沉積明顯減少； 4)肺上皮細(xì)胞Shp2基因敲除小鼠與對(duì)照組小鼠相比,BALF上清中MMP-9和TGF-β1蛋白釋放顯著性下降,肺組織勻漿中MMP-9和TGF-β1的基因水平表達(dá)明顯降低,肺MMP-9、 S100A4的表達(dá)量以及膠原纖維沉積同樣明顯減少。 2、離體實(shí)驗(yàn)： 1)細(xì)胞活力檢測(cè)中,不同濃度的CSE(0.5%～5%)與肺上皮細(xì)胞MLE-12分別培養(yǎng)24、48、72h,呈濃度和時(shí)間依賴引起MLE-12細(xì)胞損傷,細(xì)胞的存活率下降； 2)CSE呈濃度依賴誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞Shp2基因和蛋白表達(dá)以及誘導(dǎo)Shp2磷酸化表達(dá)； 3)CSE呈濃度和時(shí)間依賴誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞表達(dá)MMP-9基因和蛋白； 4)Shp2特異性抑制劑PHPS1抑制CSE誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞表達(dá)MMP-9基因和蛋白； 5)MLE-12細(xì)胞Shp2基因沉默后能顯著減少CSE誘導(dǎo)表達(dá)MMP-9蛋白； 6)CSE刺激人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549,呈濃度和時(shí)間依賴誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)TGF-β1基因和蛋白； 7)Shp2特異性抑制劑PHPS1抑制CSE誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)TGF-β1基因； 8)CSE可誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞JNK和p38信號(hào)蛋白的磷酸化,對(duì)Erkl/2和Akt信號(hào)蛋白磷酸化無明顯影響。JNK抑制劑SP600125能顯著抑制CSE誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞MMP-9釋放,PHPS1能顯著降低由CSE誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞JNK磷酸化。 結(jié)論： 1)Shp2特異性抑制劑PHPS1干預(yù)小鼠或?qū)⑿∈蠓紊掀ぜ?xì)胞Shp2基因敲除均可顯著減輕 吸煙引起的肺纖維化； 2)Shp2特異性抑制劑PHPS1干預(yù)肺上皮細(xì)胞或?qū)⒎紊掀ぜ?xì)胞Shp2基因沉默均可顯著減 少CSE誘導(dǎo)的MMP-9和TGF-β1表達(dá)。 3) Shp2/JNK信號(hào)通路可能是吸煙誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 本研究結(jié)果提示Shp2是香煙煙霧引發(fā)肺纖維化可能的潛在靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：Shp2 吸煙 COPD 肺纖維化 MMP-9 TGF-β1
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563.9
【目錄】：

• 摘要2-5
• Abstract5-7
• 符號(hào)說明7-9
• 1、引言9-12
• 2、材料與方法12-22
• 2.1 材料12-15
• 2.2 方法15-21
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析21-22
• 3、整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-29
• 3.1、吸煙對(duì)小鼠肺組織Shp2表達(dá)的影響22
• 3.2、吸煙對(duì)小鼠肺纖維化指標(biāo)的影響22-24
• 3.3、PHPS1對(duì)小鼠肺纖維化模型的影響24-26
• 3.4、肺上皮細(xì)胞Shp2基因敲除對(duì)吸煙小鼠肺纖維化指標(biāo)的影響26-28
• 整體實(shí)驗(yàn)小結(jié)28-29
• 4、離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-37
• 4.1、香煙提取物CSE對(duì)肺上皮細(xì)胞的影響29-33
• 4.2、Shp2特異性抑制劑PHPS 1對(duì)CSE誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞表達(dá)MMP-9和TGF-β1基因與蛋白的影響33-34
• 4.3、Shp2基因沉默肺上皮細(xì)胞對(duì)CSE誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞表達(dá)MMP-9蛋白的影響34-35
• 4.4、Shp2對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)肺纖維化機(jī)制研究35-36
• 離體實(shí)驗(yàn)小結(jié)36-37
• 5、討論37-40
• 6、下一步工作展望40-41
• 參考文獻(xiàn)41-46
• 綜述46-50
• 參考文獻(xiàn)49-50
• 致謝50-51
• 作者簡歷及在讀期間所發(fā)表的論文51-52

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在香煙誘導(dǎo)肺纖維化中的調(diào)節(jié)作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：329366