研究目的:本實驗研究香煙煙霧提取物（Cigarette Smoke Extract,CSE）是否能誘導RLE-6TN細胞發(fā)生線粒體自噬,并進行了相關機制的初步探討,為慢性阻塞性肺疾�。–hronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）的治療提供新的思路。研究方法:1.MTT比色法測定香煙煙霧提取物（Cigarette Smoke Extract,CSE）對RLE-6TN細胞生長的抑制作用,確定CSE的最適刺激時間和濃度。2.透射電鏡檢測RLE-6TN細胞在CSE刺激下的線粒體形態(tài)變化。3.流式細胞術或多功能酶標儀定量檢測方法檢測RLE-6TN細胞線粒體膜電位（Mitochondrial Membrane Potential,MMP）、細胞內(nèi)活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平、線粒體內(nèi)ROS水平及ATP的變化。4.Western blotting方法和免疫組織化學法檢測LC3B、P62的表達水平。5.Western blotting方法檢測細胞總蛋白和線粒體/胞漿蛋白中PINK1、Parkin、Drp1及Mfn2的表達... 

【文章來源】：蘭州大學甘肅省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

CSE處理RLE-6TN細胞后的生長抑制率（%）*P﹤0.05，***P﹤0.001Fig.1GrowthinhibitionrateofcellstreatedwithCSEatdifferenttimesanddifferent

14圖 2 透射電鏡檢測線粒體損傷情況Fig.2 Transmission electron microscopy was used to detect mitochondrial damage.透射電鏡檢測線粒體損傷情況：A. Control 組（×10000），B. Control 組（×20000），C. 5%CSE 組（×10000），D. 5%CSE 組（×20000）。2.2 CSE 誘導的 RLE-6TN 細胞線粒體膜電位（MMP）變化使用不同濃度的 CSE 刺激 RLE-6TN 細胞后，用羅丹明 123 探針進行孵育，F(xiàn)lexstation 3 多功能酶標儀定量檢測發(fā)現(xiàn)，與 Control 組相比，CSE 組平均熒光強度占比（%）顯著降低，且呈劑量依賴關系（P﹤0.05）（圖-3B）。選取濃度為5%CSE 處理細胞，流式細胞儀檢測顯示，CSE 組平均熒光強度占比（%）顯著降低（P﹤0.05）（圖-3A）。

圖 3 羅丹明 123 染料檢測細胞 MMP 變化Fig.3 The changes of intracellular mitochondrial membrane potential(MMP) were detected byRhodamine 123. *P﹤0.05，**P﹤0.01，***P ﹤0.001.流式細胞術檢測 RLE-6TN 細胞內(nèi) MMP 變化（A），a：Control 組，b：5%CSE 組，c：CCCP 組，d：與 Control 組比較，*P﹤0.05；多功能酶標儀定量檢測 MMP 變化（B），與Control 組比較，**P﹤0.01，***P﹤0.001。2.3 CSE 誘導的 RLE-6TN 細胞活性氧變化（1）CSE 誘導的 RLE-6TN 細胞內(nèi) ROS 變化使用 5%CSE 刺激細胞，用 DCFH-DA 探針對 RLE-6TN 細胞進行孵育，F(xiàn)lexstation 3 多功能酶標儀檢測發(fā)現(xiàn)，與 Control 組相比，CSE 組平均熒光強度占比（%）顯著增高（P﹤0.05）（圖 4-A）。由此可見，在 CSE 刺激下，RLE-6TN細胞內(nèi) ROS 水平升高。


本文編號：3278513