目的:建立一種切實(shí)可行的胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元培養(yǎng)及純化方法,研究MEF2C在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)表達(dá)對(duì)P物質(zhì)和低分子量神經(jīng)絲微管蛋白基因表達(dá)的影響以及MEF2C與氣道高反應(yīng)性發(fā)生間可能的關(guān)系。方法:利用顯微解剖獲取足夠數(shù)量的胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié),通過胰蛋白酶+EDTA消化、交替使用NB培養(yǎng)基與加入了5-氟-2-脫氧尿嘧啶核苷酸/尿苷的抗有絲分裂NB培養(yǎng)基等方法在體外獲得純化的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,采用神經(jīng)絲蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色法與DAPI染核的方法鑒定并測(cè)定神經(jīng)元的純度。分離培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞,然后暴露于不同濃度的NGF下24小時(shí),最后用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)P物質(zhì)與低分子量神經(jīng)絲微管蛋白基因在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。通過化學(xué)轉(zhuǎn)染方法將合成的3條siRNA-Mef2c分別轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,并用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)篩選轉(zhuǎn)染效率最高的siRNA。采用化學(xué)轉(zhuǎn)染方法干擾背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)MEF2C的表達(dá),在高濃度神經(jīng)生長(zhǎng)因子刺激背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞后采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)干擾后背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)P物質(zhì)與低分子量神經(jīng)絲微管蛋白基因的表達(dá)。結(jié)果:1、獲得的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)... 

【文章來源】：中南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：45 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

免疫細(xì)胞化學(xué)熒光顯微鏡下觀翻x200地.DRGn胞體及突觸被anti一NF200標(biāo)記;e.DAPI

圖3不同濃度NGF刺激下P物質(zhì)及Nn的表達(dá):A隨培養(yǎng)基內(nèi)NGF濃度的不同P物質(zhì)表達(dá)的變化，B隨培養(yǎng)基內(nèi)NGF濃度的不同Nn表達(dá)的變化表1不同濃度NGF刺激下P物質(zhì)與Nfl表達(dá)的變化GeneNFLP一Sllbname10ng/ml3Ong/mlIOOng/ml1.32士0.071.41士0.122.23士0.203.44士0.18ZOOng/ml2.93士0.103.61士0.133siRNA一MenC干擾實(shí)驗(yàn)3.1篩選干擾效率最高的siRNA一Me幾c采用2一幽CT統(tǒng)計(jì)方法對(duì)3條干擾PC12細(xì)胞內(nèi)MefZ。的效率進(jìn)行半定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成的3條SIRNAsiRNA一Me幾c一1、siRNA一MefZc一2和siRNA一MefZc一3對(duì)Me幾c的干擾效率分別為0.04、0.54和0.66，同時(shí)我們檢測(cè)相應(yīng)siRNA一MefZc一3的脫靶效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)SIRNA一Me幾c一3干擾過程中沒有對(duì)Creb的表達(dá)形成明顯的影

圖4篩選干擾效率最高的siRNA一Menc:A3條不同siRNA一Men。干擾效率檢瀏結(jié)果BsiRNA一Me幾c一3干擾PC12細(xì)胞內(nèi)Creb的表達(dá)無變化3.2對(duì)DRG神經(jīng)元原代細(xì)胞內(nèi)Me幾c干擾效率的檢測(cè)采用2一△△CT統(tǒng)計(jì)方法對(duì)采用s1RNA一Me幾c一3干擾后DRG神經(jīng)元原代細(xì)胞內(nèi)MefZc表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NGF高濃度(loong/rn工)組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)MefZc的表達(dá)較對(duì)照組下降50%(P<0.05)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)沒有檢測(cè)到對(duì)Creb表達(dá)的影響。P物質(zhì)與NFL在RNA水平的表達(dá)受到了干擾MEFZC的影響，分別較對(duì)照組下降41%(p<0.05)與61%(p<0.05)。在NGF低濃度(long/mL)組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)MefZc的表達(dá)較對(duì)照組下降41%，P物質(zhì)與NFL在RNA水平的表達(dá)受到了干擾MEFZC的影像，分別較對(duì)照組下降16%(P<0.05)與36%(P<0.05)。NGF10一創(chuàng).LsiR人A~co.口rol、GFIO.側(cè).LsiRXA一、IefZe一3NGF100一留.L51只NA一eo一打。l

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)培養(yǎng)的大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P物質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)作用（英文）[J]. 楊向東,劉真,劉花香,王麗紅,馬春紅,李振中.  Neuroscience Bulletin. 2007(04)
[2]Effects of respiratory syncytial virus infection on the airway neuronal plasticity and its relationship to the bronchial hyperresponsiveness in rats[J]. SHEN Xiao-yue, PAN Pin-hua, WU E-sheng and HU Cheng-ping Department of Respiratory Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China (Shen XY, Pan PH, Wu ES and Hu CP).  Chinese Medical Journal. 2006(02)



本文編號(hào)：3261549