本文關(guān)鍵詞：HCMV對人肺成纖維細(xì)胞致纖維化介質(zhì)表達(dá)、上皮細(xì)胞A549轉(zhuǎn)分化的影響及有關(guān)信號機制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:進(jìn)行性肺纖維化是結(jié)締組織病患者死亡的重要原因之一。大量研究表明病毒感染可以促進(jìn)纖維化疾病的發(fā)生。HCMV(人巨細(xì)胞病毒)是自身免疫疾病發(fā)生發(fā)展的重要誘因之一。一方面,HCMV編碼的多種基因產(chǎn)物紊亂正常的人體免疫功能進(jìn)而形成持續(xù)感染,另一方面,HCMV同時可編碼多種基因產(chǎn)物促進(jìn)細(xì)胞增殖,進(jìn)而促發(fā)纖維化。結(jié)締組織疾病常在自身免疫紊亂的基礎(chǔ)上發(fā)生肺組織纖維化,稱之為結(jié)締組織相關(guān)性肺纖維化(CTD-ILD)。目前,自身免疫疾病患者伴發(fā)肺間質(zhì)纖維化的機制尚不清楚,治療手段有限。已經(jīng)有研究表明皰疹病毒家族中的Epstein-Barr virus(EBV)和human herpesvirus 6(HHV-6)在自身免疫疾病的發(fā)生中起重要作用。且有研究發(fā)現(xiàn),在血管自身免疫疾病中患者外周血中有大量HCMV(人巨細(xì)胞病毒)感染標(biāo)志的CD4+T細(xì)胞存在。由此,我們設(shè)想HCMV可能籍其促纖維化性作用進(jìn)而參與CTD-ILD的發(fā)生發(fā)展。研究目的:本研究通過體外試驗觀察HCMV病毒株感染的人外周血單個核細(xì)胞對肺成纖維細(xì)胞重要的致纖維化介質(zhì)表達(dá)、人肺泡上皮細(xì)胞A549細(xì)胞因子、EMT(上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)的影響及HCMV重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一US28的作用,旨在探討HCMV免疫抑制患者肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用機制進(jìn)而為HCMV相關(guān)性肺纖維化防治提供更多的理論基礎(chǔ)。研究方法:HCMV病毒株AD169感染人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)后與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),成纖維細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的變化將培養(yǎng)的病毒用TCID50(即半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)方法定量后,按MOI(感染復(fù)數(shù))為0.1感染外周血單個核細(xì)胞1小時后,棄去上清,用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)反復(fù)清洗2次,離心重懸后與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),分別在6h,12h,24h收取細(xì)胞,提取RNA逆轉(zhuǎn)錄后,采用熒光定量PCR技術(shù)檢測IL-10,IFN-γ,TNF-α,IP-10,IL-17A,IL-6,TGF-β表達(dá)的變化。第二部分HCMV重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一US28作用于上皮細(xì)胞A549引起的細(xì)胞因子、表型轉(zhuǎn)化及IL6-p STAT3信號的作用細(xì)胞鋪種至六孔培養(yǎng)板24小時后,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將質(zhì)�？蛰d體及含有目的片段US28的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肺泡上皮細(xì)胞A549,24小時后收取細(xì)胞,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄后采用熒光定量PCR技術(shù)檢測指標(biāo)IL-10,IL-6,TGF-β,Fibronectin,E-cadherin量的變化,western bloting檢測蛋白水平間充質(zhì)轉(zhuǎn)化表型及信號通路的變化。研究結(jié)果:第一部分HCMV病毒株AD169感染外周血單個核細(xì)胞(PBMC)后與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),成纖維細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的變化篩查了病毒感染后與免疫抑制、纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子的變化,發(fā)現(xiàn)免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10在各個時間點都明顯升高,而具有抗病毒效應(yīng)的IFN-γ卻隨著時間的遷移逐漸降低,與纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子TNF-α,IP-10,IL-17A,IL-6均表現(xiàn)出不同程度的升高,特別是IL-6升高尤為明顯,但相對應(yīng)的TGF-β卻無明顯變化。第二部分HCMV重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一US28作用于上皮細(xì)胞A549引起的細(xì)胞因子及通過US28-IL6-pstat3路徑引起的相關(guān)表型的變化以US28質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,觀察刺激后細(xì)胞因子、EMT部分標(biāo)志物的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了US28的上皮細(xì)胞免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10表達(dá)有升高趨勢,IL-6明顯升高,而TGF-β卻明顯下降,上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的標(biāo)志fibronectin升高,而相應(yīng)的上皮性標(biāo)志E-cadherin表達(dá)降低。蛋白水平表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)錄水平一致的結(jié)果,fibronectin明顯升高而E-cadherin明顯下降,并且p-STAT3表達(dá)也是增高的,而其抑制劑降低p-STAT3水平,同時上皮性細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin水平升高而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志fibronectin降低。結(jié)論:1.HCMV感染可誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞A549纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)與表型轉(zhuǎn)化;2.US28是HCMV誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞、A549纖維化介質(zhì)及表型轉(zhuǎn)化的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一,IL-6/stat3是上述過程的關(guān)鍵信號通路。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563
【目錄】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-18
• 第一部分HCMV感染外周血單個核細(xì)胞（PBMC）后對成纖維細(xì)胞致纖維化介質(zhì)的影響18-33
• 材料（資料、內(nèi)容）與方法18-29
• 結(jié)果29-30
• 討論30-33
• 第二部分HCMV重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一US28對肺泡上皮細(xì)胞A549致纖維化細(xì)胞因子表達(dá)、表型的影響及信號機制33-48
• 材料（資料、內(nèi)容）與方法33-45
• 結(jié)果45-46
• 討論46-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 綜述56-79
• 參考文獻(xiàn)61-79
• 附錄79-84
• 作者簡介及讀研期間主要成果84-85
• 致謝85-86

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本文編號：326152