本文關(guān)鍵詞：卵清蛋白誘導(dǎo)哮喘模型的建立及GPR97基因在哮喘中的作用評估，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：哮喘(Asthma)是種以氣道高反應(yīng)性(AHR)、可逆性氣流阻塞以及氣道壁重構(gòu)為主要特征的慢性炎癥性疾病。多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等都涉及到哮喘的致病過程。哮喘的發(fā)病是遺傳因素和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果,涉及多種基因以及蛋白的作用及其信號通路,其中多種G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptors, GPCRs)在哮喘中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。GPR97是一種粘附性G蛋白偶聯(lián)受體,高表達(dá)于多種免疫細(xì)胞中,如：肥大細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等,但GPR97在過敏性哮喘疾病中的作用尚無報道,在肥大細(xì)胞中發(fā)揮的功能尚不清楚。本文擬建立穩(wěn)定的哮喘模型,探究GPR97基因?qū)Ψ蚀蠹?xì)胞功能的影響以及在哮喘發(fā)病過程中的作用。 研究內(nèi)容和結(jié)果概述如下： 1、哮喘小鼠模型的構(gòu)建與評估。本實驗采用卵清蛋白(OVA)致敏和激發(fā)的方法建立小鼠哮喘模型。小鼠分別用50μg、100μg、25OμgOVA致敏,1%OVA激發(fā),建立小鼠哮喘模型,并通過行為學(xué)和多種生理生化指標(biāo)進(jìn)行評價。行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),模型組小鼠均出現(xiàn)抓耳撓腮、弓背、大小便失禁等癥狀；肺重體重比統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),模型組肺重占體重的比例明顯增加,表明肺部水腫隨致敏OVA濃度增大而加重；肺組織HE染色發(fā)現(xiàn),隨著致敏OVA濃度增大,模型組小鼠肺部氣道壁重構(gòu)現(xiàn)象更為明顯,主要表現(xiàn)為支氣管上皮增厚,氣道、血管周圍炎癥細(xì)胞大量浸潤；肺泡灌洗液中總細(xì)胞計數(shù)結(jié)果表明,炎癥細(xì)胞的數(shù)目隨OVA濃度的增大而增多。接著,通過免疫學(xué)和生化方法檢測了幾種炎癥細(xì)胞的變化情況：通過肺組織中嗜酸性過氧化物酶(EPO)的活性間接檢測了肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞的含量,肺組織PAS染色檢測肺部高腳杯細(xì)胞增生、粘液分泌狀況,肺組織肥大細(xì)胞免疫組化檢測了肥大細(xì)胞在肺部的分布及數(shù)目。以上實驗均表明,隨著致敏OVA的濃度增大,肺部這三種細(xì)胞的比例增加明顯。最后,采用RT-PCR和ELISA方法檢測Th1、Th2相關(guān)炎癥因子IL-4、IL-6、IL-13、IFN-γ以及血清中總IgE的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-6、IL-13、IgE的表達(dá)均隨致敏OVA濃度增大而上調(diào),但I(xiàn)FN-γ的表達(dá)呈下調(diào)趨勢。上述實驗表明,哮喘發(fā)生過程中,Th2的優(yōu)勢分化非常明顯。 2、哮喘細(xì)胞模型的建立及評價。原代分離小鼠骨髓細(xì)胞,IL-3和SCF誘導(dǎo)向肥大細(xì)胞分化。誘導(dǎo)四周后,FACS檢測證實分離純化得到較純的肥大細(xì)胞。用哮喘模型血清致敏,OVA激發(fā),熒光定量PCR和ELISA方法檢測與肥大細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的分泌。發(fā)現(xiàn)OVA誘導(dǎo)下,肥大細(xì)胞分泌產(chǎn)生較多的IL-4、IL-6、IL-13三種炎癥因子。 3、GPR97在哮喘中的作用。首先,分離原代WT和GPR97-/-小鼠骨髓細(xì)胞,并誘導(dǎo)向肥大細(xì)胞分化,間時建立哮喘細(xì)胞模型。熒光定量PCR和ELISA方法檢測IL-4、IL-6、IL-13三種炎癥因子,發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比,這三種細(xì)胞因子在GPR97-/-小鼠分化來的肥大細(xì)胞中的表達(dá)均下調(diào)。其次,以250μgOVA作為致敏濃度,同時建立和評估WT和GPR97-/-小鼠哮喘模型。通過WT和GPR97-/-小鼠行為學(xué)觀察、肺重體重比統(tǒng)計、肺組織HE染色、嗜酸性粒細(xì)胞含量檢測、肺組織PAS染色、肥大細(xì)胞免疫組化檢測、熒光定量PCR和ELISA檢測Th1、Th2相關(guān)炎癥因子及血清中總IgE的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT和GPR97-/-小鼠哮喘發(fā)病癥狀在肺部水腫、氣道重構(gòu)和粘液分泌、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的含量及細(xì)胞因子的RNA水平和蛋白水平都沒有顯著性差異。 綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn)250μg/只的OVA作為致敏藥物濃度,腹腔注射致敏14天(7天/次)后,用OVA霧化激發(fā)7天能建立安全穩(wěn)定的小鼠哮喘模型,這為我們后續(xù)開展基因敲除鼠哮喘相關(guān)研究提供了有利的保證。GPR97基因能顯著影響肥大細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌,但對小鼠哮喘的發(fā)生沒有顯著作用。
【關(guān)鍵詞】：哮喘 肥大細(xì)胞 G蛋白偶聯(lián)受體 GPR97
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述 哮喘與G蛋白偶聯(lián)受體的研究概述12-29
• 1 哮喘12-17
• 2 G蛋白偶聯(lián)受體17-19
• 3 G蛋白偶聯(lián)受體與哮喘19-22
• 4 動物模型在研究哮喘病中的重要性22
• 5 哮喘動物模型的研究策略22-24
• 參考文獻(xiàn)24-29
• 第二部分 實驗29-79
• 第一章 卵清蛋白致敏、激發(fā)C57BL/6小鼠哮喘模型的建立與評估29-52
• 一、引言29-30
• 二、材料與方法30-40
• 三、結(jié)果40-50
• 四、分析與討論50-52
• 第二章 野生型與GPR97~(-/-)小鼠原代肥大細(xì)胞的分離與細(xì)胞因子釋放檢測52-61
• 一、引言52-53
• 二、材料與方法53-56
• 三、結(jié)果56-59
• 四、分析與討論59-61
• 第三章 野生型與GPR97~(-/-)小鼠哮喘模型的建立與對比評估61-76
• 一、引言61-62
• 二、材料與方法62-65
• 三、結(jié)果65-74
• 四、分析與討論74-76
• 參考文獻(xiàn)76-79
• 發(fā)表文章79-80
• 致謝80

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：卵清蛋白誘導(dǎo)哮喘模型的建立及GPR97基因在哮喘中的作用評估，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：313380