本實(shí)驗(yàn)的目的是針對(duì)哮喘模型進(jìn)行基因治療,IL-4和IL-13是誘發(fā)哮喘的關(guān)鍵細(xì)胞因子,IL-4、IL-13的受體重疊性構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的共刺激信號(hào),可以誘導(dǎo)STAT6的磷酸化。IL-4-STAT6途徑在B細(xì)胞IgE型轉(zhuǎn)換的過程中起到重要的作用,IL-13也可以激活STAT6途徑并誘導(dǎo)IgE的生成。經(jīng)證明鼠IL-4變異體C118（C末端118以后的氨基酸刪除）蛋白有效的阻止了IL-4和IL-13誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)和IgE水平,同時(shí)也阻止了過敏性氣道嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)和AHR。目前鼠IL-4的雙變異蛋白Q116D/Y119D（IL-4受體拮抗劑-IL-4RA）經(jīng)證明可以阻止哮喘模型肺組織中STAT6的磷酸化,同時(shí)也阻止了過敏性氣道嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道高反應(yīng)性和血漿IgE水平的升高。本實(shí)驗(yàn)就是采用能夠拮抗IL-4和IL-13的IL-4變異體（Q116D/Y119D）-IL-4RA對(duì)哮喘模型進(jìn)行基因治療。首先用IL-4的突變引物對(duì)刺激后的BALB/C小鼠脾細(xì)胞懸液用RT-PCR的方法實(shí)現(xiàn)了IL-4突變基因擴(kuò)增,隨后將目的基因IL-4RA克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達(dá)載體并檢測(cè)其在真核細(xì)胞BHK-21中的表達(dá),然后利... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：114 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染及包裝Fig.1:Transfectionandpackagingforretrovirus

.3 IL-4RA 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度測(cè)定[101]行滴度測(cè)定的前一天，將 NIH3T3 細(xì)胞以 1×105傳代于 6 孔板l待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%-80%匯片時(shí)，棄掉原培養(yǎng)液，加入1ml含有L 病毒上清的新鮮培養(yǎng)液，37℃下溫浴 4h，然后再加入新鮮培養(yǎng)培養(yǎng) 48h，將細(xì)胞 1 10 傳代于新的 6 孔板中，加 G418（500μ 天，記數(shù)所形成的克隆數(shù)，按如下公式計(jì)算滴度：G418 抗性 CFU病毒原液的體積（ml）×稀釋度。.3 高滴度重組病毒的篩選已知滴度的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，篩選出滴度最高的重組病毒-80下一步實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果 G418 對(duì)于 PA317 細(xì)胞的最小致死劑量測(cè)定狀態(tài)良好的 PA317 細(xì)胞在含有不同濃度 G418 的培養(yǎng)液中G418 濃度大于 200μg/ml 細(xì)胞皺縮死亡（結(jié)果見 3-1）。

染滴度測(cè)定 NIH3T3 細(xì)胞在含有不同濃度 G4大于 400μg/ml 細(xì)胞皺縮死亡，G41l。感染正常生長(zhǎng)的 NIH3T3 細(xì)胞后，胞死亡，被病毒感染的細(xì)胞獲得 GT3 細(xì)胞克隆染色后的結(jié)果。圖 3-2 PA317 細(xì)胞克隆PA317 clone transfected by recombinant repLNC-IL-4RA after G418 selection selec


本文編號(hào)：3109957