本文關(guān)鍵詞：慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能減退及其機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種以持續(xù)存在的呈進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限為特征的常見(jiàn)疾病,伴有氣道和肺對(duì)有害顆�；驓怏w所致慢性炎癥反應(yīng)的增加。氣道、肺實(shí)質(zhì)及肺血管的慢性炎癥是COPD的特征性改變,多種炎癥細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)參與了COPD的發(fā)病過(guò)程。越來(lái)越多的研究資料表明,嚴(yán)重的COPD患者存在發(fā)生侵襲性肺曲霉病(IPA)的高風(fēng)險(xiǎn)。 曲霉是一種條件致病菌,對(duì)于免疫功能正常的人,曲霉孢子吸入人體后可以被天然免疫系統(tǒng)清除；但是免疫功能低下的病人,曲霉孢了吸入在肺部后,可以在肺部大量繁殖,在一定條件下導(dǎo)致肺部的侵襲性感染并可隨血循環(huán)播散到其他器官,甚至可能導(dǎo)致死亡。研究資料表明,COPD是ICU患者曲霉感染重要的危險(xiǎn)因素。有學(xué)者認(rèn)為大劑量使用糖皮質(zhì)激素、合并基礎(chǔ)疾病、反復(fù)運(yùn)用廣譜抗生素、肺功能III級(jí)以上、營(yíng)養(yǎng)不良等因素可能增加COPD患者曲霉感染的風(fēng)險(xiǎn),但這種觀點(diǎn)缺乏大量相關(guān)的研究資料來(lái)佐證。而本實(shí)驗(yàn)室前期的臨床研究資料表明,COPD患者穩(wěn)定期全身使用糖皮質(zhì)激素、住院期間使用三種以上抗生素、以及抗生素使用時(shí)間大于10d是發(fā)生IPA的相關(guān)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。COPD患者曲霉易感性增加的具體機(jī)制尚不清楚,可能與機(jī)體防疫功能的減退——尤其是與巨噬細(xì)胞吞噬功能的減退有關(guān)。 國(guó)內(nèi)外大量的研究表明,長(zhǎng)期吸煙可能影響AM (alveolar macrophages,AM)功能,導(dǎo)致肺的免疫功能受損,從而使COPD患者呼吸系統(tǒng)細(xì)菌定植以及肺部感染發(fā)生率增高。肺泡巨噬細(xì)胞是機(jī)體的第一道防線,在清除煙曲霉分生孢子的過(guò)程中扮演著重要的角色。巨噬細(xì)胞要通過(guò)吞噬作用與殺滅作用才能將曲霉孢子清除,吞噬作用作為清除過(guò)程的首要步驟,就顯得尤為重要。巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用需依賴其表面的模式識(shí)別受體(Pathogen recognition receptors, PRRs)對(duì)曲霉孢子的識(shí)別。在所有相關(guān)的PRRs中,與曲霉分生孢子關(guān)系較為密切的是Toll樣受體(Toll Like Receptors, TLRs)其中,TLR2是TLRs中與煙曲霉關(guān)系最為密切的一種。它能識(shí)別煙曲霉PAMP,如β-葡聚糖、角質(zhì)素、肽聚糖、甘露糖蛋白及其他細(xì)胞壁成分,通過(guò)MyD88髓樣分化蛋白或非MyD88轉(zhuǎn)接蛋白,激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子,從而引起多種細(xì)胞因子——如IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α等的表達(dá)分泌,促進(jìn)巨噬細(xì)胞的殺菌和吞噬活性。Meier等研究證實(shí),小鼠巨噬細(xì)胞識(shí)別曲霉孢子依賴TLR2。進(jìn)一步的體外研究提示,巨噬細(xì)胞通過(guò)TLR2等識(shí)別曲霉孢了,引起促炎因子的產(chǎn)生與釋放,同時(shí)募集中性粒細(xì)胞至感染部位。 本研究采用煙熏十內(nèi)毒素滴入的方法建立COPD大鼠模型,并通過(guò)病理米評(píng)價(jià)模型。在成功建立COPD大鼠模型的基礎(chǔ)上,我們研究了COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)曲霉孢子吞噬功能的變化、分泌炎癥因子的特點(diǎn)及可能的調(diào)控機(jī)制；從基因水平和蛋白水平研究了COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)情況。 研究方法： 1慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及鑒定 1.1COPD大鼠模型的建立：采用煙熏+內(nèi)毒素滴入的方法,動(dòng)物每天置于煙室內(nèi)三次,每次45分鐘,COPD組向煙室內(nèi)注入香煙煙霧,對(duì)照組注入空氣,共30天(第9、19天除外)。第9、19天試驗(yàn)組氣道內(nèi)注入濃度為1mg/mL內(nèi)毒素200μL,對(duì)照組滴入等量生理鹽水。 1.2COPD大鼠模型的鑒定：第30天將大鼠處死,支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)；取下右肺,經(jīng)多聚甲醛固定、病理切片、HE染色,用病理評(píng)分的方法對(duì)模型進(jìn)行鑒定。 1.3數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示,服從正態(tài)分布的方差齊性計(jì)量資料均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,方差分析不齊時(shí)采用Welch近似t檢驗(yàn),以a=0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 2慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌和吞噬功能的變化 2.1COPD大鼠模型的建立同上。 2.2肺泡巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：對(duì)大鼠進(jìn)行肺泡灌洗,將收集的BALF離心后獲得的細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2孵育2h后去掉未貼壁細(xì)胞,并利用CD68單抗對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),呈綠色熒光即為肺泡巨噬細(xì)胞。 2.3培養(yǎng)上清炎癥因子的測(cè)定：同上法分離大鼠肺泡巨噬細(xì)胞并培養(yǎng)2h,收集培養(yǎng)上清,采用ELISA測(cè)定肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子TNF-α、MIP-2、IL-10及IL-1β的表達(dá)。 2.4肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)曲霉孢子的吞噬率及吞噬指數(shù)的測(cè)定：BALF離心后獲得的細(xì)胞以1×106/mL接種到六孔板,37℃,5%CO2孵育2h后去上清,加入曲霉孢子混懸液20μL,補(bǔ)足培養(yǎng)體積至1mL,37℃,5%CO2孵育2h,取出蓋玻片行PAS染色,計(jì)數(shù)吞噬率及吞噬指數(shù)。吞噬率=(吞噬孢子的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞總數(shù))×100%；吞噬指數(shù)=吞噬孢子的總數(shù)/吞噬孢子的巨噬細(xì)胞數(shù)。 2.5肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB的表達(dá)檢測(cè)：提取肺泡巨噬細(xì)胞胞漿、胞核蛋白,運(yùn)用、Vestern blot技術(shù)測(cè)定NF-κB的表達(dá)。 2.6數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±S表示,服從正態(tài)分布的方差齊性計(jì)量資料均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,方差分析不齊時(shí)采用Welch近似t檢驗(yàn),以α=0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 3慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá) 3.1COPD大鼠模型的建立同上。 3.2肺泡巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)及處理：將收集的BALF離心后獲得的細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2孵育2h后去掉未貼壁細(xì)胞,然后于各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中分別加入Pam3CYK4(每孔加1ug,濃度1mg/mL)和曲霉孢子(每孔加2.5×106個(gè)孢子)及1mL生理鹽水,各自培養(yǎng)4h后收集細(xì)胞。 3.3肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)：提取細(xì)胞總蛋白,運(yùn)用qRT-PCR及Westernblot技術(shù),檢測(cè)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)。 3.4數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X+S)表示,主效應(yīng)與交互效應(yīng)采用析因分析,單獨(dú)效應(yīng)采用單因素方差分析,以a=0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果 1慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立 1.1成功建立COPD模型：COPD組肺組織鏡下可見(jiàn)支氣管纖毛柱狀上皮呈鋸齒樣增生增厚,纖毛倒伏,上皮脫落,支氣管腔內(nèi)中性粒細(xì)胞及黏液蓄積,管壁結(jié)締組織增生,平滑肌增厚,可見(jiàn)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),支氣管周圍可見(jiàn)淋巴小結(jié)。肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡壁變薄、斷裂,肺泡腔擴(kuò)大,部分融合成較大的囊腔。COPD組支氣管炎癥評(píng)分顯著高于對(duì)照組(4.33+1.16vs.1.33±0.58,P=0.016)。COPD組平均內(nèi)襯間隔(MLI)顯著高于對(duì)照組[(168.77+11.35)μmvs.(93.61±4.16)μm,P=0.000)]。BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)：COPD組BALF中白細(xì)胞總數(shù)較對(duì)照組顯著升高[(2.34+0.15)×108/L vs.(1.72±0.30)×108/LP=0.002],分類以肺泡巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主[(72.0±±2.2)%和(18.3±±8.3)%]。 2慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌和吞噬功能的變化 2.1細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、MIP-2、IL-10、IL-1p的濃度：COPD組肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、MIP-2的濃度顯著高于對(duì)照組(均為P=0.000),IL-10、IL-1p濃度在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P0.05)。 2.2肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)曲霉孢子的吞噬率及吞噬指數(shù)：對(duì)照組肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)曲霉孢子的吞噬率顯著高于COPD組(P=0.000)；而對(duì)照組與COPD組肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)曲霉孢子的吞噬指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.053)。 2.3NF-κB p65的表達(dá)：COPD組肺泡巨噬細(xì)胞胞漿NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P=0.011),而胞核的表達(dá)水平則顯著高于對(duì)照組(P=0.003)。 3慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá) 3.1大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因表達(dá)水平 3.1.1經(jīng)析因分析顯示,對(duì)照組與COPD組相比,COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=680.60,P=0.000)。三個(gè)處理因素相比,曲霉孢子對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度影響最大,Pam3CYK4次之,生理鹽水對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度影響最小,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=353.21,P=0.000)。煙霧和生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4存在交互效應(yīng)(F=17.79,P=0.000),即COPD組分別滴加生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4后,肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的差異比對(duì)照組大；可認(rèn)為煙霧可影響經(jīng)生理鹽水、曲霉孢了或Pam3CYK4刺激的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因的表達(dá)水平。 3.1.2基礎(chǔ)狀態(tài)下,COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4后,COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度均低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000) 3.1.3滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度均高于基礎(chǔ)狀態(tài),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的對(duì)照組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度也均高于基礎(chǔ)狀態(tài),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。 3.2大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)水平 3.2.1經(jīng)析因分析顯示,對(duì)照組與COPD組相比,COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=349.58,P=0.000)。三個(gè)處理因素相比,曲霉孢子對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)水平影響最大,Pam3CYK4次之,生理鹽水對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)水平影響最小,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=77.08,P=0.000)。煙霧和生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4存在交互效應(yīng)(F=18.07,P=0.000),即COPD組分別滴加生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4后,肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)水平的差異比對(duì)照組大；可認(rèn)為煙霧可影響經(jīng)生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4刺激的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白的表達(dá)水平。 3.2.2基礎(chǔ)狀態(tài)下,COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白的表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4后,COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白的表達(dá)水平均低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。 3.2.3滴加曲霉孢了或Pam3CYK4的COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白的表達(dá)水平均高于基礎(chǔ)狀態(tài),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的對(duì)照組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白的表達(dá)水平也均高于基礎(chǔ)狀態(tài),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)采用煙熏+內(nèi)毒素氣道滴注的方法成功建立了COPD大鼠模型,其表現(xiàn)為以中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主的慢性炎癥；肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB p65活化,TNF-α、MIP-2等促炎因子表達(dá)水平增加,吞噬功能減退,此可能與長(zhǎng)期的煙霧暴露導(dǎo)致的肺泡巨噬細(xì)胞TLR2不能正常上調(diào)相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：慢性阻塞性肺疾病 肺泡巨噬細(xì)胞 Toll樣受體2 核因子-κB 炎癥
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R563.9
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-21
• 第一章 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立21-30
• 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑21-23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-25
• 3 結(jié)果25-27
• 4 討論27-30
• 第二章 慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌和吞噬功能的變化30-47
• 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑30-33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法33-41
• 3 結(jié)果41-45
• 4 討論45-47
• 第三章 慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)47-63
• 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑47-49
• 2 實(shí)驗(yàn)方法49-55
• 3 結(jié)果55-60
• 4 討論60-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 中英文縮寫對(duì)照表67-68
• 成果68-69
• 致謝69-71
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明71

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能減退及其機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：310341