本文關(guān)鍵詞：hsa-miR-181a靶向TLR4調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥介質(zhì)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：預(yù)測(cè)并擬定靶向作用于TLR4基因（TLR4mRNA）的miRNA。觀察所擬定的miRNA對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥介質(zhì)的影響并探討其機(jī)制。 方法：通過(guò)生物信息學(xué)方法分析TLR4mRNA3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)利用在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)擬定可能靶向作用于TLR4基因的miRNA。通過(guò)ELISA測(cè)定巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。采用qPCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)擬定miRNA相對(duì)表達(dá)量。使用RT-PCR測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表達(dá)水平。通過(guò)western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白水平。運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)分析擬定miRNA與TLR4mRNA的靶向結(jié)合活性。 結(jié)果：⑴經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)擬定miR-181a作為靶向調(diào)控TLR4基因（TLR4mRNA）的待驗(yàn)證miRNA。⑵在巨噬細(xì)胞被轉(zhuǎn)染2.5nM、5.0nM、10.0nM的miR-181a mimic及對(duì)照的mimic，待0h、24h、48h、72h后,再分別予LPS刺激(時(shí)限為6h)，發(fā)現(xiàn)miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均較相應(yīng)對(duì)照組及0h組顯著降低（均P＜0.05），尤其以5.0nM、48h組最為明顯；但當(dāng)巨噬細(xì)胞被轉(zhuǎn)染2.5nM、5.0nM、10.0nM的miR-181a inhibitor及對(duì)照的inhibitor時(shí)，0h、24h、48h、72h后,再分別予LPS刺激(時(shí)限為6h)，則發(fā)現(xiàn)miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均較其對(duì)照組及0h組顯著升高（均P＜0.05），其中以5.0nM、48h組最為明顯。⑶在巨噬細(xì)胞分別被轉(zhuǎn)染5.0nM的miR-181a mimic（或?qū)φ盏膍imic）和miR-181a inhibitor（或?qū)φ盏膇nhibitor）48h，接著予LPS刺激6h后，發(fā)現(xiàn)miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組與其對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)miR-181a相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而miR-181ainhibitor轉(zhuǎn)染組與其對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)miR-181a相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-181a mimic和miR-181a inhibitor處理組與各自對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)TLR4mRNA表達(dá)水平均無(wú)顯著差異（均P＞0.05），但miR-181a mimic處理組與其對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白水平及TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05），而miR-181a inhibitor處理組與其對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白水平及TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表達(dá)水平均顯著升高（均P＜0.05）。⑷通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)：miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組T293細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；miR-181a mimic+miR-181ainhibitor共轉(zhuǎn)染組T293細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性顯著高于miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。 結(jié)論：①hsa-miR-181a可通過(guò)下調(diào)TLR4表達(dá)，負(fù)向調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥介質(zhì)。②hsa-miR-181a通過(guò)與TLR4mRNA3′UTR直接結(jié)合，，阻遏TLR4mRNA翻譯，抑制TLR4基因表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：hsa-miR-181a toll樣受體4 THP-1巨噬細(xì)胞 炎癥 急性肺損傷
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-13
• 第一部分 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)13-17
• 1. 原理13
• 2. 方法13-14
• 2.1 TLR4 mRNA 3′UTR 序列獲取及其二級(jí)結(jié)構(gòu)分析13-14
• 2.2 Targetscan 預(yù)測(cè)以 TLR4 為靶基因的 miRNA14
• 2.3 MiRDB 預(yù)測(cè)以 TLR4 為靶基因的 miRNA14
• 3. 結(jié)果14-16
• 3.1 TLR4 mRNA 3′UTR 序列及其二級(jí)結(jié)構(gòu)14-15
• 3.2 Targetscan 預(yù)測(cè)結(jié)果15
• 3.3 MiRDB 預(yù)測(cè)結(jié)果15-16
• 4. 小結(jié)16-17
• 第二部分 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 miR-181a 下調(diào) TLR4 表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥介質(zhì)17-41
• 1. 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞17
• 2. 主要試劑17-18
• 3. 主要儀器與器材18-19
• 4. 實(shí)驗(yàn)方法19-30
• 4.1 高表達(dá) TLR4 細(xì)胞株的選取19-20
• 4.2 細(xì)胞培養(yǎng)20
• 4.3 轉(zhuǎn)染及 LPS 刺激20-21
• 4.4 細(xì)胞上清液的收集21
• 4.5 ELISA21-22
• 4.6 總 RNA 提取22-23
• 4.7 qPCR 與 RT-PCR23-25
• 4.8 蛋白提取及定量25-26
• 4.9 western blot26-27
• 4.10 相對(duì)熒光素酶活性法檢測(cè) miR-181a 與 TLR4 mRNA 的靶向結(jié)合活性27-30
• 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-41
• 5.1 ELISA 測(cè)定的培養(yǎng)基中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量30-34
• 5.2 qPCR 檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi) miR-181a 相對(duì)表達(dá)量34
• 5.3 RT-PCR 檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi) TLR4 mRNA 表達(dá)水平34-35
• 5.4 western blot 檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi) TLR4 蛋白水平35-36
• 5.5 RT-PCR 檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi) TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 表達(dá)水平36-39
• 5.6 熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)的 miR-181a 與 TLR4 mRNA 的靶向結(jié)合活性39-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-47
• 主要英文縮略語(yǔ)索引47-48
• 文獻(xiàn)綜述48-53
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 碩士期間發(fā)表的論文53-54
• 致謝54-55
• 基金資助55

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 李琦,錢桂生,張青,王長(zhǎng)征;不同劑量脂多糖對(duì)大鼠急性肺損傷效應(yīng)的觀察[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年10期

  本文關(guān)鍵詞：hsa-miR-181a靶向TLR4調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥介質(zhì)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：306482