一、Smads蛋白在TGF-β₁體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化中作用 目的：肺肌成纖維細(xì)胞在肺纖維化發(fā)生機制中起重要作用，其分化標(biāo)志是α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β₁可通過Smads蛋白家族成員傳遞信號發(fā)揮生物作用，因此本研究主要探討在TGF-β₁誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化過程中，各Smad蛋白對α-SMA基因表達(dá)的調(diào)控作用。 方法： 1、體外培養(yǎng)人胚胎肺成纖維細(xì)胞（HFL-F），TGF-β₁干預(yù)后通過Western blot及RT-PCR分析α-SMA基因mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化，同時用免疫熒光法觀察細(xì)胞形態(tài)改變。 2、構(gòu)建含人α-SMA基因啟動子序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒（p895-Luc）和Smad2突變表達(dá)質(zhì)粒(pSmad2^mut)：以人基因組DNA為模板用PCR擴增人α-SMA基因啟動子-895～+9bp序列，插入到pGal3-basic質(zhì)粒的MluⅠ和... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

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【學(xué)位級別】：博士

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1體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化中的作用">第一部分 Smads蛋白在TGF-β₁體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化中的作用
    前言
    實驗材料
        一、細(xì)菌菌株及質(zhì)粒載體
        二、質(zhì)粒構(gòu)建所需的酶以及其它試劑
        三、PCR擴增引物
        四、細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)
        五、細(xì)胞因子其他試劑及試劑盒
        六、主要儀器
    實驗方法
1在體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肺肌成纖維細(xì)胞分化">        一、TGF-β₁在體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肺肌成纖維細(xì)胞分化
        二、含人a-SMA基因啟動子序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
2-Smad2^mut表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定">        三、pCS₂-Smad2^mut表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
1誘導(dǎo)人a-SMA基因啟動子活性的影響">        四、Smads蛋白在TGF-β₁誘導(dǎo)人a-SMA基因啟動子活性的影響
1誘導(dǎo)人a-SMA基因蛋白表達(dá)的影響">        五、Smads蛋白在TGF-β₁誘導(dǎo)人a-SMA基因蛋白表達(dá)的影響
        六、統(tǒng)計學(xué)處理
    結(jié)果
1能在體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肺肌成纖維細(xì)胞分化">        一、TGF-β₁能在體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肺肌成纖維細(xì)胞分化
        二、質(zhì)粒的酶切和測序鑒定
            1、含人a-SMA基因啟動子序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒p895-Luc的成功構(gòu)建
2-Smad2^mut表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建">            2、pCS₂-Smad2^mut表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建
            3、其它質(zhì)粒的鑒定
        三、p895-Luc熒光素酶活性的檢測
1誘導(dǎo)人a-SMA基因表達(dá)的作用">        四、Smads在TGF-β₁誘導(dǎo)人a-SMA基因表達(dá)的作用
            1、Smad3在TGF-β-1誘導(dǎo)人a-SMA基因表達(dá)的作用
1誘導(dǎo)人a-SMA基因表達(dá)的作用">            2、Smad2在TGF-β₁誘導(dǎo)人a-SMA基因表達(dá)的作用
1誘導(dǎo)人a-SMA基因表達(dá)的作用">            3、Smad7在TGF-β₁誘導(dǎo)人a-SMA基因表達(dá)的作用
    討論
    小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第二部分 Smad3對博萊霉素誘導(dǎo)肺維化模型中肌成纖維細(xì)胞分化的作用
    前言
    實驗材料
        一、實驗動物
        二、主要儀器和試劑
    實驗方法
        一、博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型的制作
        二、動物分組
        三、觀察項目
        四、動物處理
        五、檢測指標(biāo)
            1、肺組織羥脯氨酸含量的測定
            2、肺組織切片染色
            3、Western blot定量分析肺組織α-SMA的表達(dá)
        六、統(tǒng)計學(xué)處理
    結(jié)果
        一、動物的一般情況
        二、肺組織的病理學(xué)改變
        三、肺組織羥脯氨酸含量變化
        四、肺組織α-SMA的蛋白表達(dá)
    討論
    小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的影響">第三部分 干擾素-γ、地塞米松對TGF-β₁誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的影響
    前言
    實驗材料
        一、細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)
        二、主要儀器和試劑
    實驗方法
        一、Western blot
        二、細(xì)胞免疫熒光法
        三、細(xì)胞免疫化學(xué)法
        四、羥脯氨酸的測定
        五、RT-PCR檢測膠原Ⅰ和Ⅲ mRNA的表達(dá)
        六、統(tǒng)計學(xué)處理
    結(jié)果
        一、IFN-γ和DEX對α-SMA表達(dá)的影響
        二、IFN-γ和DEX對細(xì)胞形態(tài)的影響
        三、IFN-γ和Dex對膠原合成的影響
1／Smads信號途徑的影響">        四、IFN-γ對TGF-β₁／Smads信號途徑的影響
            1、IFN-γ不影響Smad2／3和Smad7內(nèi)源行性表達(dá)
            2、IFN-γ不抑制Smad2／3磷酸化和細(xì)胞核轉(zhuǎn)位
    討論
    小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
綜述一
綜述二
附錄1 主要溶液的配制
附錄2 縮略語表
致謝



本文編號：2910568