研究背景 在過去的數(shù)十年內(nèi)，哮喘在世界范圍內(nèi)發(fā)病人數(shù)有一定的上升，尤其是高收入國家。人類對支氣管哮喘的發(fā)病機理有了更深入的認識，哮喘治療手段也日益增多，但哮喘的發(fā)病率和死亡率并沒有明顯下降。相反，在許多國家哮喘的發(fā)病率和死亡率不降反升，成為人類健康的嚴重威脅。 近年來研究表明，輔助性T細胞(Th)Th1/Th2功能失衡，Th2活化亢進在哮喘發(fā)病機制中起重要作用。哮喘患者體內(nèi)Th0向Th2分化過度，Th2細胞產(chǎn)生多種細胞因子如IL-4、IL-5及IL-13等促進過敏原特異性IgE的合成，介導骨髓嗜酸性粒細胞分化、成熟及向肺組織趨化，促進氣道黏液分泌和氣道高反應(yīng)性，從而導致哮喘的發(fā)生�？ń槊�(BCG)是結(jié)核分支桿菌減毒活疫苗，是一種很強的Th1免疫反應(yīng)刺激劑，能糾正Th1/Th2失衡。目前為止，以動物進行的研究均顯示BCG接種能明顯抑制OVA致敏和激發(fā)所致的氣道嗜酸性粒細胞浸潤，降低氣道高反應(yīng)性以及Th2型細胞因子的表達。 白介素-10(IL-10)是炎癥抑制因子，由Th2細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、調(diào)節(jié)性T細胞等分泌。DC等細胞分泌的IL-10，誘發(fā)調(diào)節(jié)性T細胞-1(Tr1)進一步分泌IL-10，大量的IL-10可抑制Th2細胞，從而抑制哮喘和過敏性疾病，IL-10對哮喘和過敏性疾病的作用機制仍不明確，IL-10各種研究資料結(jié)果差異很大，哮喘患者BALF和血中的IL-10上升和下降的表達都有報道。IL-10對IL-1、IL-4、IL-12、TNFα、NF-κB等多種炎癥因子具有抑制作用，從而間接抑制哮喘患者的肺組織EOS炎癥和氣道高反應(yīng)性等，合成IL-10代表機體的保護性調(diào)節(jié)。 哮喘患者的肺組織EOS炎癥，是呼吸道變應(yīng)性炎癥的一個重要特征。血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)，作為特異性地介導嗜酸粒細胞浸潤到肺組織的粘附分子，在哮喘中可能扮演了重要的角色。VCAM-1除了引起EOS的粘附作用，可能還具有共刺激分子作用，參加機體的免疫調(diào)節(jié)。VCAM-1是粘附分子的一員，是一類調(diào)節(jié)細胞與細胞之間相互粘附、相互作用的膜表面糖蛋白，主要表達在活化內(nèi)皮細胞、上皮細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞上。VCAM-1的基因表達主要由轉(zhuǎn)錄因子NF-κB控制。各種致炎因子，如IL-1、IL-4、IL-12、TNFα和IFN-γ等誘導VCAM-1的表達。由于IL-10對IL-4、TNFα、NF-κB等多種炎癥因子具有抑制作用，IL-10可能通過廣泛地抑制炎癥因子，間接對VCAM-1等粘附分子起一定的作用。 本次課題設(shè)計，通過觀察IL-10和VCAM-1的表達，探討卡介苗對哮喘治療的作用機制，為哮喘的實驗理論研究提供支持。 研究目的 本研究給予初生幼鼠早期多次小劑量BCG接種，觀察預(yù)防哮喘的長期(25周)效果。在此過程中，通過觀察IL-10、VCAM-1在小鼠支氣管肺泡灌洗液、肺組織中的表達，探討B(tài)CG預(yù)防哮喘的機制。 研究方法 C57BL/6小鼠分為NS/NS(對照組)、NS/OVA組(模型組)和BCG10~5/OVA組、BCG10~(5-3)/OVA組。小鼠出生0、7、14天子減毒活疫苗BCG皮內(nèi)注射接種，第5周、第7周2次卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏，25周3次霧化激發(fā)建立哮喘模型。最后一次抗原激發(fā)48h后收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，肺組織石蠟包埋和冰凍保存。肺組織HE染色，觀察哮喘模型是否成功。RT-PCR方法測定肺組織VCAM-1和IL-10的mRNA水平，ELISA方法測定BALF的IL-10水平，肺組織石蠟切片免疫組化方法觀察VCAM-1的表達情況。 研究結(jié)果 1．氣道炎癥變化 肺組織病理切片HE染色顯示，抗原激發(fā)48h后模型組肺組織EOS和炎癥細胞浸潤與對照組相比明顯增多(n=6，P＜0.05)，BCG10~5/OVA和BCG10~(5-3)/OVA肺組織EOS和炎癥細胞浸潤與模型組相比減少(n=6，P＜0.05)。 2．RT-PCR檢測肺組織IL-10 mRNA和VCAM-1 mRNA的水平 模型組、BCG10~5/OVA組、BCG10~(5-3)/OVA組的IL-10 mRNA表達與對照組相比均明顯增加，差異有顯著性(n=6，p＜0.05)。而VCAM-1 mRNA各組與對照組間比較并無明顯差異(n=6，p＞0.05)。 3．ELISA檢測BALF中IL-10蛋白表達的水平 BCG10~5/OVA組IL-10水平與模型組、OVA+BCG10~(5-3)組相比有顯著升高(n=6，p＜0.05)，模型組、BCG10~(5-3)/OVA組與對照組相比有下降，但無顯著性差異(n=6，p＞0.05)。 4．免疫組化檢測肺組織中VCAM-1蛋白表達的水平 肺組織病理切片免疫組化染色顯示，VCAM-1主要表達于支氣管粘膜氣道上皮、支氣管平滑肌、血管內(nèi)皮、血管周圍淋巴等細胞胞漿中。氣道上皮細胞哮喘模型組、BCG10~5/OVA組、BCG10~(5-3)/OVA組均呈不同程度的陽性(深棕黃色到淺棕黃色不等)表達，而對照組中呈弱陽性(淺棕黃色)表達。用秩和檢驗，四組樣本總體有顯著差異性，P＜0.05。樣本兩兩比較顯示，BCG10~5/OVA組與對照組、模型組、BCG10~(5-3)/OVA組比較有顯著性差異(n=6，p＜0.05)。 結(jié)論 1．小鼠生命早期接種BCG，預(yù)防哮喘有長期(25周)作用，同時與BCG接種的劑量大小有關(guān)。 2．IL-10對哮喘起保護性調(diào)節(jié)作用，可能與APC的免疫調(diào)節(jié)、Treg的激活、Th2細胞的抑制等有關(guān)。 3．BCG治療后VCAM-1表達的升高，可能對哮喘小鼠免疫調(diào)節(jié)起一定的作用。VCAM-1在哮喘的發(fā)生中可能有復(fù)雜的作用，一方面參與了哮喘小鼠肺組織嗜酸性粒細胞炎癥浸潤的病理過程，另一方面可能作為協(xié)同刺激信號激活CD4~+T細胞，起免疫監(jiān)督作用。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2007
【中圖分類】：R562.25
【部分圖文】：

匆加;’’砍驢2007“碩士學位論文圖2一1:對照組:氣道上皮完整，纖毛排列整齊，杯狀細胞少見，基底層以及平滑肌層較薄，肺小血管內(nèi)皮光滑，血管、氣道周圍見極少量的炎癥細胞，以巨噬細胞為主，未見到嗜酸性粒細胞。(HE染色，SPX巧0)圖2一2:模型組:氣道上皮細胞增生肥大，上皮不完整，纖毛排列紊亂，上皮下基底層增厚，平滑肌肥大增生，氣道和血管周圍、肺泡隔內(nèi)見大量嗜酸性粒細胞浸潤。(HE染色， SPx150)

平滑肌層較薄，肺小血管內(nèi)皮光滑，血管、氣道周圍見極少量的炎癥細胞，以巨噬細胞為主，未見到嗜酸性粒細胞。(HE染色，SPX巧0)圖2一2:模型組:氣道上皮細胞增生肥大，上皮不完整，纖毛排列紊亂，上皮下基底層增厚，平滑肌肥大增生，氣道和血管周圍、肺泡隔內(nèi)見大量嗜酸性粒細胞浸潤。(HE染色， SPx150)

匆沁介認掌2007“碩士學位論文圖2一3:BCGIOS/ovA組:氣道上皮略增生肥大，上皮相對完整，纖毛排列較紊亂，杯狀細胞可見，上皮下基底層以及平滑肌層略增厚，血管、氣道周圍可見少量嗜酸性粒細胞。(HE染色，SPX一50)圖2一4:BCG105一3/OVA組:氣道上皮細胞略增生肥大，上皮相對完整，纖毛排列較紊亂，杯狀細胞可見，上皮下基底層略增厚，平滑肌略肥大增生，氣道和血管周圍、肺泡隔可見少量嗜酸性粒細胞浸潤。(HE染色， SPx150)
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本文編號：2893048