發(fā)布時間：2020-11-11 07:41

　　 IκBα突變體靶向抑制NF-κB對哮喘血清-內(nèi)皮穿越模型中樹突狀細胞分化的研究 樹突狀細胞(dendritic cell,DC)作為體內(nèi)已知功能最強的抗原呈遞細胞(antigen presenting cell,APC),在免疫激活以及免疫耐受中發(fā)揮重要作用�！癟h1/Th2偏移”假說是哮喘發(fā)病的主要免疫學機制,近期研究認為哮喘是機體對變應(yīng)原的“免疫耐受”機制異常和/或缺陷而導(dǎo)致體內(nèi)Th1/Th2偏移。而DC的類型、成熟狀態(tài)以及局部微環(huán)境在決定Th0細胞向調(diào)節(jié)性T細胞或效應(yīng)性T細胞分化中起著關(guān)鍵作用。DC分化發(fā)育成熟依賴于核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)激活。利用未成熟DC誘導(dǎo)T細胞耐受在許多免疫性疾病中得到了應(yīng)用,但用于哮喘預(yù)防和治療的成功報道還很少。因人外周血DC數(shù)目有限,目前對DC的研究往往依賴于體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系如GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)體系,但實際上在體內(nèi)很難出現(xiàn)如此高水平的細胞因子內(nèi)環(huán)境。最近,權(quán)威雜志Science相繼報道了模擬正常人單核細胞在體內(nèi)遷移分化發(fā)育成DC的內(nèi)皮細胞穿越模型和正常人單核細胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中2～3天分化為DC的研究。因此,本課題首先構(gòu)建內(nèi)皮細胞穿越模型,研究正常人外周血CD14+單核細胞是否能在正常人血清和哮喘患者血清中通過此模型分化為DC,并比較單核細胞在正常血清和哮喘血清條件下分化的DC表型、功能的差異;然后以不易降解的新穎NF-κB超強抑制劑(AdIκBαM)轉(zhuǎn)染正常人外周血單核細胞,利用哮喘患者血清誘導(dǎo)該單核細胞在內(nèi)皮細胞單層中發(fā)生逆穿越,觀察AdIκBαM靶向抑制NF-κB是否影響單核細胞在哮喘血清-內(nèi)皮穿越模型中分化為DC,并進一步探討其對分化細胞的表型和功能的影響。 第一部分支氣管哮喘血清對單核細胞內(nèi)皮(逆)穿越分化的樹突狀細胞表型及功能的影響 目的利用內(nèi)皮穿越模型研究支氣管哮喘患者血清對正常人單核細胞分化而來的DC表型及功能的影響。方法分離、培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞,分別以20%正常人血清(正常血清組)和哮喘患者血清(哮喘血清組)培養(yǎng)基重懸正常人外周血CD14+單核細胞,加入內(nèi)皮細胞單層上,48 h后收集逆穿越內(nèi)皮的細胞。同時以新鮮分離單核細胞和培養(yǎng)48 h單核細胞為對照。Giemsa染色及光學顯微鏡觀察細胞形態(tài);流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞表型;混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)檢測細胞刺激同源異體CD4+ T細胞增殖的能力;ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清液中IL-12 p70、IL-10水平;Western-blot檢測細胞胞漿IκBα和NF-κB p65表達。結(jié)果正常血清和哮喘血清均可誘導(dǎo)正常人單核細胞在內(nèi)皮穿越模型中逆穿越分化為樹枝樣突起的細胞(endothelial-associated dendritic cell,eDC),其表面單核細胞標志CD14表達顯著下降,而共刺激分子CD80、CD86表達增高。與正常血清組相比,哮喘血清組eDC表面CD80、CD83表達明顯增高(分別P0.05、P0.01),而CD86、HLA-DR的表達及刺激T淋巴細胞增殖的能力無顯著差異(P均0.05)。哮喘血清組eDC培養(yǎng)上清中IL-12 p70、IL-10分泌均高于正常人血清組(分別P0.05、P0.01)。另外,Western-blot檢測發(fā)現(xiàn),與正常血清組比較,哮喘血清組細胞胞漿pIκBα表達增加,而NF-κB p65表達降低。結(jié)論正常人單核細胞在正常血清和哮喘血清均可逆穿越內(nèi)皮分化為eDC樣細胞,哮喘患者血清則進一步通過部分上調(diào)eDC表面分子的表達、促使其分泌IL-10、IL-12p70而誘導(dǎo)eDC的成熟。 第二部分IκBα突變體靶向抑制NF-κB對哮喘血清-內(nèi)皮穿越模型中樹突狀細胞分化的影響 目的觀察IκBα突變體轉(zhuǎn)染對正常人CD14+單核細胞在哮喘血清-內(nèi)皮穿越模型中DC分化及其功能的影響。方法分離、培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞。正常人CD14+單核細胞分為3組:未轉(zhuǎn)染組、AdLacZ(β-半乳糖苷酶)轉(zhuǎn)染組和AdIκBαM轉(zhuǎn)染組。20%哮喘患者血清重懸單核細胞,加入內(nèi)皮細胞單層上,48 h后收集逆穿越細胞。⑴Western-blot法檢測逆穿越細胞胞漿中IκBα、IκBαM的表達;Giemsa染色及光學顯微鏡觀察細胞形態(tài);流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞表面分子CD14、CD80、CD86、CD83及HLA-DR的表達;酶聯(lián)免疫法( ELISA)分析細胞培養(yǎng)上清中IL-12 p70和IL-10的水平;混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)分析細胞刺激同種異體CD4+ T淋巴細胞增殖的能力;免疫熒光技術(shù)及電泳遷移率試驗(EMSA)檢測細胞中NF-κB活性。⑵逆穿越細胞經(jīng)室塵螨變應(yīng)原(Der p 1)刺激后,與同種異體CD4+ T淋巴細胞共培養(yǎng)72 h。ELISA方法測定培養(yǎng)液中IL-4和IFN-γ水平;Western-blot方法測定T淋巴細胞中T-bet、GATA-3及逆穿越細胞(eDC)中STAT6、pSTAT6表達水平。結(jié)果⑴Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)AdIκBαM轉(zhuǎn)染單核細胞逆穿越分化而來的細胞胞漿中出現(xiàn)突變型(外源性) IκBαM基因,該細胞仍表現(xiàn)為樹枝樣突起,與未轉(zhuǎn)染單核細胞分化而來的細胞一樣低表達單核細胞標志CD14。而其表面分子CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表達、IL-12 p70的分泌及刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力均顯著低于未轉(zhuǎn)染組和AdLacZ轉(zhuǎn)染組分化細胞( P均 0.05),且AdIκBαM轉(zhuǎn)染組分化細胞的NF-κB p65核表達陽性率和NF-κB DNA結(jié)合灰度值較未轉(zhuǎn)染組和AdLacZ轉(zhuǎn)染組顯著降低( P均 0.05)。⑵未轉(zhuǎn)染組和AdLacZ轉(zhuǎn)染組分化細胞經(jīng)Der p 1刺激后誘導(dǎo)CD4+ T淋巴細胞產(chǎn)生IL-4和IFN-γ,以IFN-γ顯著升高(P 0.01),而AdIκBαM組分化細胞抑制T淋巴細胞產(chǎn)生IL-4和IFN-γ,伴隨著T淋巴細胞中T-bet、GATA-3及eDC中pSTAT6表達降低。結(jié)論⑴AdIκBαM轉(zhuǎn)染單核細胞可經(jīng)內(nèi)皮穿越分化為未成熟eDC樣細胞。⑵AdIκBαM轉(zhuǎn)染單核細胞來源的eDC在接觸變應(yīng)原后仍保持未成熟狀態(tài),并且可能通過抑制eDC中IL-12 p70分泌和STAT6激活而抑制T-bet、GATA-3表達,而阻止T淋巴細胞向Th1/Th2分化。 第三部分過表達IκBα突變體的樹突狀細胞對哮喘CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞作用的研究 目的探討哮喘患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)目與功能的變化及過表達IκBα突變體單核細胞來源的eDC對哮喘患者外周靜脈血中調(diào)節(jié)性T細胞的影響。方法⑴流式細胞術(shù)(FCM)檢測哮喘組和正常對照組外周靜脈血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞占CD4+ T細胞的百分比;分離CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞,與CD4+ T細胞、室塵螨變應(yīng)原(Der p 1)共培養(yǎng)72 h,四唑鹽比色(MTT)法檢測CD4+ T細胞增殖。⑵分離、培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞。正常人CD14+單核細胞分為:未轉(zhuǎn)染組、AdLacZ轉(zhuǎn)染組和AdIκBαM轉(zhuǎn)染組。用20 %哮喘患者血清重懸單核細胞,加入內(nèi)皮細胞單層上,48 h后收集的逆穿越細胞與哮喘患者外周血中CD4+CD25- T細胞及室塵螨變應(yīng)原(Der p 1)共培養(yǎng)72 h,流式細胞術(shù)(FCM)檢測CD4+ T細胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞百分比,酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測上清液中IL-10及TGF-β1含量。結(jié)果⑴哮喘組外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞占CD4+ T細胞百分比低于正常對照組(P0.05);CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞能抑制哮喘CD4+ T細胞增殖,而哮喘組與正常組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞抑制CD4+ T細胞增殖的能力無顯著差異(P均0.05)。⑵與未轉(zhuǎn)染組eDC和AdLacZ組eDC相比,過表達IκBα突變體的eDC能誘導(dǎo)哮喘患者CD4+CD25- T細胞向CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞極化并分泌IL-10 (P均 0.05)。結(jié)論⑴CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)目減少可能是導(dǎo)致哮喘患者免疫失調(diào)的重要原因。⑵過表達IκBαM基因的eDC在體外能促進哮喘CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的分化,增加抑制性細胞因子IL-10的分泌。提示DC在誘導(dǎo)T淋巴細胞對過敏原的免疫耐受過程中起十分重要的作用。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R562.25
【部分圖文】：

經(jīng)典激活途徑：IκB激酶(IKK)誘導(dǎo)IκBα N端絲氨酸32/36磷酸化/p65二聚體入核。B，旁路激活途徑：NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)誘導(dǎo)I活化, 從而導(dǎo)致p100發(fā)生磷酸化依賴性剪切, 生成有活性的p52:并進入細胞核與靶基因結(jié)合, 調(diào)節(jié)基因的表達。圖 2 NF-κB 的經(jīng)典和旁路激活途徑Ser32 Ser36DRHDSGLDS MKD×MV S plice + PolyAIκBαM cDNA以編碼蛋氨酸（M，203-205 bp）的 ATG 作為起始密碼，定點克隆的 IκBαM 基因（203-1003 bp），正好去除了其上游的 Ser32 和 Se化位點，推導(dǎo)的新穎 IκBαM 蛋白分子量為 30 kDa。

倒置顯微鏡下見：臍靜脈內(nèi)皮細胞呈鋪路石樣鑲嵌排列的胞為扁平多角形(×100)；B，間接免疫熒光染色：細胞核周圍胞綠色熒光(選自 6 次實驗中的 1 次)。圖 1.1 臍靜脈內(nèi)皮細胞的鑒定35

未穿越單核細胞逆穿越細胞A，倒置顯微鏡觀察，未穿越單核細胞表面光滑，而逆穿越細胞表面有毛刺狀突起；B：Giemsa 染色：未穿越單核細胞表面平滑，而逆穿越細胞表面有毛刺狀突起(×400)。(選自 6 次實驗中的 1 次)。圖 1.2 單核細胞源 eDC 的形態(tài)36
【參考文獻】

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1 張明順;張江全;王慧娟;柯瑤;劉衍春;季曉輝;李玉峰;;內(nèi)皮細胞穿越模型中系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者樹突狀細胞分化及功能狀態(tài)的初步研究[J];中華風濕病學雜志;2006年01期

2 ;Effects of adenoviral gene transfer of mutated IκBα,a novel inhibitor of NF-κB,on human monocyte-derived dendritic cells[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年05期

3 覃壽明;施煥中;覃雪軍;陳一強;鐘小寧;;支氣管哮喘患者外周血中的CD_4~+CD_(25)~+T淋巴細胞的測定[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2006年04期

本文編號：2878931