本文關(guān)鍵詞：蛋白激酶SPAK在海水吸入型肺損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 溺水是一個(gè)非常危險(xiǎn)的公共傷害事件，，但是卻常常被人們忽略。它是僅次于道路交通事故的第二大意外傷害的原因，尤其在青少年群體當(dāng)中更為突出。水經(jīng)口鼻吸入到肺，可以破壞肺泡上皮的屏障功能，導(dǎo)致肺水腫及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而急性肺損傷（acute lung injury，ALI），嚴(yán)重時(shí)還可以進(jìn)展成為急性呼吸窘迫綜合征（acuterespiratory distress syndrome，ARDS）。先前的研究已經(jīng)表明，海水吸入引起肺損傷主要是由于高滲的刺激引起核轉(zhuǎn)錄因子κB （NF-κB）的磷酸化激活和炎癥因子的釋放。然而NF-κB在海水吸入型肺損傷（seawater inhalation induced acute lung injury,SWI-ALI）中的作用機(jī)制并未完全闡明。 STE20相關(guān)脯氨酸丙氨酸豐富的蛋白激酶（Ste20-like proline-/alanine-rich kinase,SPAK）屬于STE20激酶家族中的重要成員。 SPAK廣泛表達(dá)在許多物種和多種器官、組織中。SPAK的最主要功能是磷酸化和激活Na+-K+-2CL-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na-K-Cl cotransporter，NKCC）。NKCC是一個(gè)重要的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，介導(dǎo)了許多病理?xiàng)l件下的炎癥反應(yīng)。除此之外，SPAK在細(xì)胞增殖和分化，以及腸道炎癥的調(diào)控方面也展現(xiàn)出了重要的作用。在很多實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明，SPAK可以激活p38通路，表明其在介導(dǎo)高滲引起的炎癥反應(yīng)方面起著至關(guān)重要的作用。研究表明，在高滲誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎性腸病模型中，SPAK的過(guò)高表達(dá)可以加劇小鼠的結(jié)腸炎的程度，其原因可能與SPAK的過(guò)高表達(dá)引起了腸壁上皮細(xì)胞屏障功能的障礙以及腸壁細(xì)胞炎性細(xì)胞因子釋放的增加有關(guān)。據(jù)此，我們推測(cè)，SPAK可能以類似的機(jī)制也參與到了海水吸入型肺損傷時(shí)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1．通過(guò)復(fù)制海水吸入型肺損傷模型，觀察海水吸入后肺組織SPAK表達(dá)的變化。 2．研究引起SPAK表達(dá)變化的調(diào)節(jié)通路，明確其上游的調(diào)節(jié)分子。 3．通過(guò)siRNA技術(shù)干擾SPAK的表達(dá)，研究SPAK在海水刺激時(shí)所起到的作用及其病理生理機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 實(shí)驗(yàn)一： 健康的雄性SD大鼠共30只，根據(jù)電腦產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)，將其排序并分為5組，分別為：正常組（N）、海水吸入1小時(shí)組（1H）、海水吸入3小時(shí)組（3H）、海水吸入6小時(shí)組（6H）、海水吸入12小時(shí)組（12H）。每組各有大鼠6只。從大鼠的頸部正中間突出部分切口，分開(kāi)氣管前的甲狀腺和肌肉組織以暴露氣管，經(jīng)氣管向肺內(nèi)緩慢地注入預(yù)先配制好的海水。劑量為4ml/kg，時(shí)間為4min。觀察注入海水后大鼠的表現(xiàn)，出現(xiàn)呼吸急促，經(jīng)口鼻溢出粉紅色的泡沫樣分泌物，初步確認(rèn)動(dòng)物模型建立成功。在海水吸入后的1h、3h、6h、12h分別將大鼠放血處死，并收集、保存相關(guān)的標(biāo)本。正常組的大鼠不注入海水，其余處理與實(shí)驗(yàn)組相同。 （1）將各組的大鼠放血處死后所獲得的右下肺臟標(biāo)本用紗布輕輕擦干，然后置于分析天平上進(jìn)行稱重，即獲得肺組織的濕重。烘干后稱重并記錄肺組織的干重，計(jì)算得到肺的濕干比。肺組織的濕干比反映了肺臟水腫的嚴(yán)重程度。（2）將組織塊切成5μm厚的組織切片，進(jìn)行H-E染色，觀察肺組織的結(jié)構(gòu)變化。（3）通過(guò)ELISA方法檢測(cè)各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α及IL-1β含量的變化。（4）選用免疫組織化學(xué)染色的方法觀察各組大鼠肺組織中SPAK蛋白的表達(dá)情況，包括表達(dá)的部位和表達(dá)的程度。（6）通過(guò)蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)海水吸入后肺組織中SPAK表達(dá)的改變。（7）通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)SPAK轉(zhuǎn)錄水平的改變。 實(shí)驗(yàn)二： 本部分為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中所選擇的細(xì)胞為大鼠肺泡巨噬細(xì)胞：即NR8383細(xì)胞。按時(shí)更換培養(yǎng)基傳代，保證細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)將細(xì)胞離心分離，然后更換無(wú)血清培養(yǎng)基。將細(xì)胞分成三組：正常組、海水處理組和PDTC預(yù)處理+海水組。各組的處理為：正常組不做特殊的處理，海水處理組將培養(yǎng)基更換為含有25%配方海水的培養(yǎng)基，PDTC預(yù)處理組在更換含有25%配方海水的培養(yǎng)基前30分鐘給予PDTC（200μM）預(yù)處理。其余處理同海水處理組。4小時(shí)后離心收集上清液和細(xì)胞。（1）通過(guò)Western blot方法測(cè)定PDTC預(yù)處理對(duì)海水引起的SPAK表達(dá)變化有無(wú)抑制作用。（2）通過(guò)siRNA干擾SPAK的表達(dá)，然后測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF-α及IL-1β含量的改變，從而反映SPAK在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)方面的作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)一： 1．吸入海水后肺組織的濕干比與正常情況下相比明顯增大（P0.001），顯示海水吸入可以造成肺部明顯的水腫。 2．HE染色結(jié)果顯示吸入海水后肺臟肉眼可見(jiàn)體積膨脹、增大，呈血紅色，表面散布出血點(diǎn)；光鏡下觀察可見(jiàn)肺泡壁增厚，有明顯的水腫跡象，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)炎性滲出，肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞。 3．吸入海水后肺內(nèi)細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-1β與正常情況對(duì)比有明顯的增多（P0.05），且隨著時(shí)間而不斷累積，在6小時(shí)左右達(dá)到最大值。 4．免疫組化染色結(jié)果顯示與正常組相比，海水吸入組中代表SPAK表達(dá)的深棕染的細(xì)胞明顯增多，且在細(xì)胞漿和細(xì)胞核均有分布，表明吸入海水后在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中SPAK表達(dá)明顯升高。 5．Western blot結(jié)果顯示吸入海水后肺組織受海水刺激的影響，SPAK蛋白表達(dá)明顯增加，最高可達(dá)對(duì)照組的2.7倍左右。 6．PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組SPAK轉(zhuǎn)錄較正常情況明顯升高，在3小時(shí)左右達(dá)到頂峰，約為正常水平的3.2倍左右。 實(shí)驗(yàn)二： 1．海水刺激可以明顯增加NR8383細(xì)胞中磷酸化NF-κB占總NF-κB的比值，而NF-κB的抑制劑PDTC的預(yù)處理可以明顯抑制這一反應(yīng)。PDTC的預(yù)處理同樣可以抑制海水刺激引起細(xì)胞中SPAK的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的升高。 2．海水的刺激可以明顯的增加細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的釋放，而在SPAK表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞中，海水刺激雖然也可以引起炎癥因子釋放的增加，但與未干擾組相比，釋放量明顯減少，表明炎癥反應(yīng)受到了一定程度的抑制。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)重復(fù)和觀察大鼠海水吸入型肺損傷模型，表明在海水高滲透壓的刺激下，細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯上調(diào)SPAK的表達(dá)，參與了肺的炎癥反應(yīng)，加重了急性肺損傷的程度。并且通過(guò)抑制上游NF-κB的激活，對(duì)SPAK的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程起到了調(diào)控的作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)NR8383細(xì)胞中SPAK的表達(dá)，可以顯著抑制了海水吸入所導(dǎo)致的炎癥因子釋放。
【關(guān)鍵詞】：急性肺損傷 蛋白激酶SPAK 核轉(zhuǎn)錄因子κB 海水 炎癥反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563.8
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-21
• 第一部分 蛋白激酶 SPAK 在海水吸入型肺損傷大鼠肺臟中的表達(dá)改變21-43
• 引言21
• 1 材料21-27
• 2 方法27-35
• 3 結(jié)果35-40
• 4 討論40-43
• 第二部分 蛋白激酶 SPAK 表達(dá)改變?cè)诤Ｋ胄头螕p傷中的作用和意義43-52
• 引言43
• 1 材料43-45
• 2 方法45-47
• 3 結(jié)果47-49
• 4 討論49-52
• 小結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果58-59
• 致謝59

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 高習(xí)文,修清玉,孫波,李兵,石昭泉,陳吉泉;海水淹溺肺水腫大鼠肺表面活性物質(zhì)磷脂的變化[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年08期

2 杜景霞;魏國(guó)會(huì);;肺血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能變化與急性肺損傷[J];河北醫(yī)藥;2012年23期

3 Didier Merlin;;Ste20-related proline/alanine-rich kinase:A novel regulator of intestinal inflammation[J];World Journal of Gastroenterology;2008年40期

  本文關(guān)鍵詞：蛋白激酶SPAK在海水吸入型肺損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：283857