本文關鍵詞：蛋白激酶SPAK在海水吸入型肺損傷中的作用及相關機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 溺水是一個非常危險的公共傷害事件，，但是卻常常被人們忽略。它是僅次于道路交通事故的第二大意外傷害的原因，尤其在青少年群體當中更為突出。水經口鼻吸入到肺，可以破壞肺泡上皮的屏障功能，導致肺水腫及炎癥反應，進而急性肺損傷（acute lung injury，ALI），嚴重時還可以進展成為急性呼吸窘迫綜合征（acuterespiratory distress syndrome，ARDS）。先前的研究已經表明，海水吸入引起肺損傷主要是由于高滲的刺激引起核轉錄因子κB （NF-κB）的磷酸化激活和炎癥因子的釋放。然而NF-κB在海水吸入型肺損傷（seawater inhalation induced acute lung injury,SWI-ALI）中的作用機制并未完全闡明。 STE20相關脯氨酸丙氨酸豐富的蛋白激酶（Ste20-like proline-/alanine-rich kinase,SPAK）屬于STE20激酶家族中的重要成員。 SPAK廣泛表達在許多物種和多種器官、組織中。SPAK的最主要功能是磷酸化和激活Na+-K+-2CL-協(xié)同轉運蛋白（Na-K-Cl cotransporter，NKCC）。NKCC是一個重要的離子轉運蛋白，介導了許多病理條件下的炎癥反應。除此之外，SPAK在細胞增殖和分化，以及腸道炎癥的調控方面也展現出了重要的作用。在很多實驗中已經證明，SPAK可以激活p38通路，表明其在介導高滲引起的炎癥反應方面起著至關重要的作用。研究表明，在高滲誘導小鼠結腸炎性腸病模型中，SPAK的過高表達可以加劇小鼠的結腸炎的程度，其原因可能與SPAK的過高表達引起了腸壁上皮細胞屏障功能的障礙以及腸壁細胞炎性細胞因子釋放的增加有關。據此，我們推測，SPAK可能以類似的機制也參與到了海水吸入型肺損傷時炎癥反應的調節(jié)。 實驗目的： 1．通過復制海水吸入型肺損傷模型，觀察海水吸入后肺組織SPAK表達的變化。 2．研究引起SPAK表達變化的調節(jié)通路，明確其上游的調節(jié)分子。 3．通過siRNA技術干擾SPAK的表達，研究SPAK在海水刺激時所起到的作用及其病理生理機制。 實驗方法： 實驗一： 健康的雄性SD大鼠共30只，根據電腦產生的隨機數，將其排序并分為5組，分別為：正常組（N）、海水吸入1小時組（1H）、海水吸入3小時組（3H）、海水吸入6小時組（6H）、海水吸入12小時組（12H）。每組各有大鼠6只。從大鼠的頸部正中間突出部分切口，分開氣管前的甲狀腺和肌肉組織以暴露氣管，經氣管向肺內緩慢地注入預先配制好的海水。劑量為4ml/kg，時間為4min。觀察注入海水后大鼠的表現，出現呼吸急促，經口鼻溢出粉紅色的泡沫樣分泌物，初步確認動物模型建立成功。在海水吸入后的1h、3h、6h、12h分別將大鼠放血處死，并收集、保存相關的標本。正常組的大鼠不注入海水，其余處理與實驗組相同。 （1）將各組的大鼠放血處死后所獲得的右下肺臟標本用紗布輕輕擦干，然后置于分析天平上進行稱重，即獲得肺組織的濕重。烘干后稱重并記錄肺組織的干重，計算得到肺的濕干比。肺組織的濕干比反映了肺臟水腫的嚴重程度。（2）將組織塊切成5μm厚的組織切片，進行H-E染色，觀察肺組織的結構變化。（3）通過ELISA方法檢測各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α及IL-1β含量的變化。（4）選用免疫組織化學染色的方法觀察各組大鼠肺組織中SPAK蛋白的表達情況，包括表達的部位和表達的程度。（6）通過蛋白質印跡方法檢測海水吸入后肺組織中SPAK表達的改變。（7）通過RT-PCR方法檢測SPAK轉錄水平的改變。 實驗二： 本部分為細胞實驗，實驗中所選擇的細胞為大鼠肺泡巨噬細胞：即NR8383細胞。按時更換培養(yǎng)基傳代，保證細胞處于對數生長期進行擴增。實驗前24小時將細胞離心分離，然后更換無血清培養(yǎng)基。將細胞分成三組：正常組、海水處理組和PDTC預處理+海水組。各組的處理為：正常組不做特殊的處理，海水處理組將培養(yǎng)基更換為含有25%配方海水的培養(yǎng)基，PDTC預處理組在更換含有25%配方海水的培養(yǎng)基前30分鐘給予PDTC（200μM）預處理。其余處理同海水處理組。4小時后離心收集上清液和細胞。（1）通過Western blot方法測定PDTC預處理對海水引起的SPAK表達變化有無抑制作用。（2）通過siRNA干擾SPAK的表達，然后測定細胞上清液中TNF-α及IL-1β含量的改變，從而反映SPAK在炎癥反應調節(jié)方面的作用。 實驗結果： 實驗一： 1．吸入海水后肺組織的濕干比與正常情況下相比明顯增大（P0.001），顯示海水吸入可以造成肺部明顯的水腫。 2．HE染色結果顯示吸入海水后肺臟肉眼可見體積膨脹、增大，呈血紅色，表面散布出血點；光鏡下觀察可見肺泡壁增厚，有明顯的水腫跡象，肺泡腔內可見炎性滲出，肺泡結構遭到破壞。 3．吸入海水后肺內細胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-1β與正常情況對比有明顯的增多（P0.05），且隨著時間而不斷累積，在6小時左右達到最大值。 4．免疫組化染色結果顯示與正常組相比，海水吸入組中代表SPAK表達的深棕染的細胞明顯增多，且在細胞漿和細胞核均有分布，表明吸入海水后在細胞核和細胞漿中SPAK表達明顯升高。 5．Western blot結果顯示吸入海水后肺組織受海水刺激的影響，SPAK蛋白表達明顯增加，最高可達對照組的2.7倍左右。 6．PCR結果顯示實驗組SPAK轉錄較正常情況明顯升高，在3小時左右達到頂峰，約為正常水平的3.2倍左右。 實驗二： 1．海水刺激可以明顯增加NR8383細胞中磷酸化NF-κB占總NF-κB的比值，而NF-κB的抑制劑PDTC的預處理可以明顯抑制這一反應。PDTC的預處理同樣可以抑制海水刺激引起細胞中SPAK的轉錄及翻譯水平的升高。 2．海水的刺激可以明顯的增加細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的釋放，而在SPAK表達下調的細胞中，海水刺激雖然也可以引起炎癥因子釋放的增加，但與未干擾組相比，釋放量明顯減少，表明炎癥反應受到了一定程度的抑制。 結論： 本實驗通過重復和觀察大鼠海水吸入型肺損傷模型，表明在海水高滲透壓的刺激下，細胞通過轉錄和翻譯上調SPAK的表達，參與了肺的炎癥反應，加重了急性肺損傷的程度。并且通過抑制上游NF-κB的激活，對SPAK的轉錄和翻譯過程起到了調控的作用。在體外實驗中，我們發(fā)現下調NR8383細胞中SPAK的表達，可以顯著抑制了海水吸入所導致的炎癥因子釋放。
【關鍵詞】：急性肺損傷 蛋白激酶SPAK 核轉錄因子κB 海水 炎癥反應
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563.8
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 文獻回顧15-21
• 第一部分 蛋白激酶 SPAK 在海水吸入型肺損傷大鼠肺臟中的表達改變21-43
• 引言21
• 1 材料21-27
• 2 方法27-35
• 3 結果35-40
• 4 討論40-43
• 第二部分 蛋白激酶 SPAK 表達改變在海水吸入型肺損傷中的作用和意義43-52
• 引言43
• 1 材料43-45
• 2 方法45-47
• 3 結果47-49
• 4 討論49-52
• 小結52-53
• 參考文獻53-58
• 個人簡歷和研究成果58-59
• 致謝59

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前3條

1 高習文,修清玉,孫波,李兵,石昭泉,陳吉泉;海水淹溺肺水腫大鼠肺表面活性物質磷脂的變化[J];第二軍醫(yī)大學學報;2005年08期

2 杜景霞;魏國會;;肺血管內皮細胞結構功能變化與急性肺損傷[J];河北醫(yī)藥;2012年23期

3 Didier Merlin;;Ste20-related proline/alanine-rich kinase:A novel regulator of intestinal inflammation[J];World Journal of Gastroenterology;2008年40期

  本文關鍵詞：蛋白激酶SPAK在海水吸入型肺損傷中的作用及相關機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：283857