【摘要】： 背景：特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是指原因不明并以普通型間質(zhì)性肺炎(usual interstitial pneumonia，UIP)為病理特征的一種慢性炎癥性肺疾病，病情進(jìn)行性發(fā)展，最終多因呼吸衰竭導(dǎo)致死亡，探討肺纖維化發(fā)生機(jī)制，將為其臨床治療提供新思路。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)烈而特異有絲分裂原，也是一種有效的血管形成和血管通透性因子，是主要血管生成調(diào)節(jié)因子，它與其受體結(jié)合發(fā)揮作用。VEGF主要生物學(xué)效應(yīng)是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞存活、增殖、分化、遷移和促進(jìn)新生血管形成。此外，VEGF還可誘導(dǎo)整合素表達(dá)，參與炎細(xì)胞移動(dòng)、維持其存活和促進(jìn)TGF-β1表達(dá)等，在肺纖維化形成早期過(guò)表達(dá)。但目前研究主要集中在抗腫瘤新生血管形成，其致炎作用，特別是在纖維化中作用研究較少。采用VEGF受體阻斷劑SU5416阻斷VEGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)肺纖維化，有助于探討VEGF／VEGFR信號(hào)途徑在肺纖維化中的作用及其機(jī)制。 目的：通過(guò)檢測(cè)VEGF及其受體在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表達(dá)，了解它們?cè)诜卫w維化中的變化特點(diǎn)；利用SU5416在肺纖維化不同時(shí)間對(duì)VEGF信號(hào)干預(yù)，了解其抗纖維化作用；經(jīng)TGF-β1、LDH檢測(cè)和炎性細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)等，初探SU5416的抗纖維化機(jī)制。 方法：小鼠氣管內(nèi)注入博來(lái)霉素建立肺纖維化(bleomycin-inducedpulmonary fibrosis，BPF)模型。肺組織，采用HE染色、Ashcroft評(píng)分評(píng)估纖維化程度；免疫組化法檢測(cè)VEGF、Flk-1和CD31(新生血管形成)表達(dá)；熒光定量RT-PCR分析VEGF、Flk-1 mRNA表達(dá)；western-blot法分析p-Smad3。支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，速率法檢測(cè)LDH活力和白細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類(lèi)計(jì)數(shù)；用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)法測(cè)定TGF-β1、VEGF含量。 結(jié)果 一、HE染色和Ashcroft評(píng)分： 鏡下見(jiàn)氣管內(nèi)注入博來(lái)霉素早期肺組織損傷以胸膜下區(qū)明顯，肺泡間隔輕度增寬、病灶區(qū)域巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯、膠原纖維沉積少；晚期損傷分布較廣，肺組織纖維沉積明顯、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少。對(duì)照組無(wú)明顯組織炎性浸潤(rùn)和間質(zhì)纖維沉積。 對(duì)照組第7、14和28天Ashcroft評(píng)分分別為0.325±0.016、0.333±0.017和0.340±0.019；模型組第7天肺組織Ashcroft評(píng)分明顯升高，第14和28天仍逐漸增加，與對(duì)照組比較有顯著差異(P0.01)。肺纖維化SU5416早期處理組Ashcroft評(píng)分與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較存在差異(P0.05)，與模型組、溶媒干預(yù)組和SU5416晚期處理組比較亦顯著差異(P0.01)。溶媒干預(yù)組、晚期SU5416處理組與模型組比較無(wú)顯著差異(P0.05)。 二、熒光定量RT-PCR與免疫組化： 小鼠肺組織VEGF和VEGFR-2 mRNA、蛋白表達(dá)，與對(duì)照組比較，模型組第7天VEGF、VEGFR-2明顯過(guò)表達(dá)，第14和28天逐漸下降(P0.01)。SU5416早期干預(yù)后，第7和14天VEGF和VEGFR-2 mRNA無(wú)過(guò)表達(dá)，第28天亦有降低(P0.05)；與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P0.05)；與模型組比較有顯著差異(P0.01)。溶媒干預(yù)組、晚期SU5416處理組與模型組比較無(wú)顯著差異(P0.05)。 三、ELISA檢測(cè)結(jié)果： 小鼠BALF中VEGF和TGF-β1變化，與對(duì)照組比較，模型組第7天VEGF和TGF-β1明顯過(guò)表達(dá)，第14和28天逐漸下降(P0.01)。SU5416早期干預(yù)后，第7和14天VEGF和TGF-β1無(wú)過(guò)表達(dá)，第28天亦有降低(P0.05)；與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P0.05)；與模型組比較有顯著差異(P0.01)。溶媒干預(yù)組、晚期SU5416處理組與模型組比較無(wú)顯著差異(P0.05)。 四、masson染色： 與對(duì)照組比較，模型組第7天masson蘭染膠原IOD值明顯升高，第14和28天逐漸增加(P0.01)。SU5416早期處理后，第7天蘭染膠原IOD值無(wú)增加；第14和28天稍增加，蘭染IOD值與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較有明顯差異(P0.05)；與模型組、溶媒和SU5416晚期處理組比較有顯著差異(P0.01)。溶媒干預(yù)組、晚期SU5416處理組與模型組比較無(wú)顯著差異(P0.05)。 五、分光光度法(spectrophotometry)檢測(cè)肺組織羥脯氨酸含量： 與對(duì)照組比較，模型組肺組織羥脯氨酸含量變化第7天羥脯氨酸含量明顯升高，第14和28天逐漸增加。SU5416早期處理后，第7天羥脯氨酸含量無(wú)增加；第14和28天稍增加，羥脯氨酸含量與對(duì)照組比較有明顯差異(P0.05)；與模型組比較有顯著差異(P0.01)。溶媒干預(yù)組、晚期SU5416處理組與模型組比較無(wú)顯著差異(P0.05)。 六、新生血管形成： 與對(duì)照組比較，模型組肺組織新生血管形成第7天新生血管形成明顯增多，第14和28天逐漸下降(P0.01)。SU5416早期干預(yù)后，第7和14天新生血管形成無(wú)過(guò)多現(xiàn)象，第28天稍低(P0.05)；與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P0.05)；與模型組間有顯著差異(P0.01)。溶媒干預(yù)組、晚期SU5416處理組與模型組比較無(wú)顯著差異(P0.05)。 七、western-blot檢測(cè)p-Smad3表達(dá)： SU5416早期處理組p-Smad3表達(dá)低于溶媒處理組和晚期SU5416處理組(P0.01)。溶媒干預(yù)組、晚期SU5416處理組間比較無(wú)顯著差異(P0.05)。 八、速率法檢測(cè)BALF中LDH活力： 第7、14和28天SU5416早期處理組BALF中LDH／P值分別為320.9±15.4和102.4±7.4、106.1±4.7U／mg，(P0.05)；與模型型組比較顯著降低(P0.01)；與對(duì)照組比較稍高(P0.05)。模型組和溶媒干預(yù)組間無(wú)明顯差異(P0.05)。 九、BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)： 造模后第7天，模型組、溶媒組和SU5416晚期處理組BALF中白細(xì)胞總數(shù)較對(duì)照組明顯增高，細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)以巨噬細(xì)胞增高明顯(P0.01)；SU5416早期處理組BALF中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)較模型組顯著降低(P0.05)。第14天，模型組白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞較對(duì)照組明顯高(P0.01)，與溶媒干預(yù)組和SU5416晚期處理組模型組無(wú)顯著差異(P0.05)；SU5416早期處理組巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞較對(duì)照組高，低于模型、溶媒和SU5416晚期處理組(P0.05)。第28天，各組間白細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)均無(wú)明顯改變(P均0.05)。 結(jié)論： 一、小鼠肺組織病理特點(diǎn)和Ashcroft評(píng)分說(shuō)明氣管內(nèi)注入博來(lái)霉素后建立肺纖維化動(dòng)物模型成功，并且可用于特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化等研究。免疫組化染色示，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化早期VEGF和Flk-1表達(dá)最高、后期很少表達(dá)，VEGF、VEGFR可能在肺纖維化形成中起重要作用。 二、熒光定量RT-PCR和ELISA提示，肺纖維化僅早期存在VEGF／Flk-1過(guò)表達(dá)，不同VEGF變異體演變趨勢(shì)相同；SU5416早期處理可有效阻斷早期Flk-1受體和VEGF過(guò)表達(dá)，F(xiàn)lk-1受體和VEGF有相同變化趨勢(shì)、SU5416阻斷VEGF受體后還可抑制VEGF過(guò)表達(dá)，說(shuō)明VEGF和Flk-1間存在相互促進(jìn)作用。 三、Ashcroft評(píng)分、masson染色和羥脯氨酸含量等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化過(guò)程中，肺纖維化程度、膠原和羥脯氨酸含量呈進(jìn)行性增高。早期給予SU5416可有效抑制VEGF及其受體過(guò)表達(dá)，使Ashcroft評(píng)分、膠原和羥脯氨酸含量降低。結(jié)果提示，VEGF信號(hào)在肺纖維化中有重要價(jià)值；早期給予SU5416抗肺纖維化，可能是通過(guò)抑制早期VEGF／VEGFR信號(hào)過(guò)表達(dá)實(shí)現(xiàn)。 四、經(jīng)SU5416分階段干預(yù)，觀察新生血管形成、TGF-β1和p-Smad3表達(dá)等，模型組新生血管形成、TGF-β1和p-Smad3表達(dá)等指標(biāo)變化趨勢(shì)與VEGF／Flk-1一致，與纖維化指標(biāo)相反；早期給予SU5416有效抑制新生血管形成、TGF-β1和p-Smad3表達(dá)和VEGF／Flk-1表達(dá)。提示VEGF信號(hào)途徑在肺纖維化中可能經(jīng)TGF-β1／p-Smad3途徑發(fā)揮作用；SU5416抗纖維化，可能是阻斷早期VEGF、VEGFR過(guò)表達(dá)，進(jìn)而抑制TGF-β1／p-Smad3途徑實(shí)現(xiàn)。 五、通過(guò)SU5416干預(yù)，觀察LDH活力和白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)等，發(fā)現(xiàn)模型組LDH活力和白細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類(lèi)計(jì)數(shù)變化趨勢(shì)與VEGF／Flk-1一致，與纖維化指標(biāo)相反。早期給予SU5416有效降低LDH活力、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)及VEGF／Flk-1表達(dá)，顯示VEGF表達(dá)與LDH、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)等密切相關(guān)，提示VEGF在肺纖維化早期炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；SU5416阻斷早期VEGF／VEGFR過(guò)表達(dá)，也可能抑制了VEGF炎細(xì)胞募集及其致纖維化因子釋放。 由此可見(jiàn)，VEGF／VEGFR信號(hào)僅在小鼠肺纖維化形成早期過(guò)表達(dá)，且相互促進(jìn)、共同參與肺纖維化過(guò)程，僅早期阻斷VEGFR能抑制肺纖維化，其機(jī)制可能是經(jīng)TGF-β1／Smad3途徑和VEGF的致炎作用引起肺纖維化；SU5416抗纖維化作用很可能是阻斷VEGF／VEGFRs信號(hào)途徑后，TGF-β1／Smad3途徑和VEGF的致炎作用受抑制所致。該課題從分子水平進(jìn)行研究，結(jié)果提示VEGF／VEGFR信號(hào)途徑可能是肺纖維化治療的潛在靶點(diǎn)，為深入臨床IPF等肺纖維化疾病治療措施研究打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R563.9
【圖文】：

四川大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)博士專(zhuān)業(yè)學(xué)位論文示，應(yīng)用SSPS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析(采用勺刀。.叭吸yANOVA方差分析)，以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果一、組織病理學(xué)表現(xiàn)大體改變:對(duì)照組小鼠肺組織呈粉紅色，濕潤(rùn)、有彈性、表面光滑。模型組第7和14天雙肺見(jiàn)暗紅色病灶，可見(jiàn)較多點(diǎn)、片狀白色區(qū)域，肺容積開(kāi)始降低;第28天小鼠肺容積減少，肺組織蒼白，表面凹凸不平，彈性明顯降低。

容積開(kāi)始降低;第28天小鼠肺容積減少，肺組織蒼白，表面凹凸不平，彈性明顯降低。圖1一1.小鼠肺組織HE染色(xZoo)鏡下可見(jiàn)模型組第7和14天損傷分布不均勻，以胸膜下區(qū)明顯，無(wú)明顯肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔輕度增寬、病灶區(qū)域充血、出血、水腫

小鼠肺免疫組化VEGF表達(dá)(x400)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李圣青,李煥章,楊喬欣,倪殿濤,柏常青;TGF-βRⅡ/Fc融合蛋白在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年04期

本文編號(hào)：2803624