【摘要】： 急性肺損傷(acute lung iniury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratory distress syndrome,ARDS)多由嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、胃酸吸入、脂肪栓塞等引起。雖然其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明,但多種病因引起肺泡上皮細(xì)胞的過度凋亡所致的呼吸膜損傷在其發(fā)病學(xué)中的重要作用已受到廣泛關(guān)注。 FoxA1(forkhead box A1)是Fox A翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。FoxA1能夠與下游基因啟動子區(qū)的FoxAl結(jié)合元件相結(jié)合,從而調(diào)控這些基因的表達(dá)。通過對下游基因表達(dá)的調(diào)控,FoxA1在正常細(xì)胞的增殖和分化、肝、肺、前列腺、卵巢等器官胚胎發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。但是FoxA1與ALl及肺泡上皮細(xì)胞凋亡之間有何關(guān)系,至今尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中采用cDNA微陣列檢測了LPS誘導(dǎo)的ALl小鼠肺組織基因表達(dá)譜的變化,發(fā)現(xiàn)FoxA1基因在注射內(nèi)毒素2小時的小鼠肺組織中表達(dá)上調(diào);注射內(nèi)毒素20小時后,FoxA1基因的表達(dá)水平進(jìn)一步增高,達(dá)正常水平10倍以上,但對其在內(nèi)毒素血癥及ALl發(fā)病中有何意義仍不清楚。 為了觀察FoxA1在ALI中的表達(dá)模式,本研究第一部分采用SD大鼠尾靜脈注射油酸(oleic acid,OA,0.1ml/kg)、腹腔注射LPS(15mg/kg)和氣管內(nèi)滴注LPS(2mg/kg)制備大鼠ALI模型。用肺濕/干重比例和肺損傷評分評估ALI程度。另一方面,采用過氧化氫(hydrogen peroxide,H_2O_2,0.5mM)、LPS(1000ng/ml)、TNF-α(10ng/ml)刺激原代培養(yǎng)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株制備體外細(xì)胞損傷模型。采用RT-PCR和Western blot分別檢測了FoxA1 mRNA和蛋白質(zhì)在SD大鼠ALI肺組織和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞急性損傷中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種原因所致ALI大鼠肺組織和急性肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷中FoxA1表達(dá)顯著上調(diào)。以上結(jié)果提示:FoxA1可能是一個在ALI中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。 同時,采用生物信息學(xué)分析顯示多個細(xì)胞凋亡相關(guān)基因啟動子區(qū)含有FoxA1結(jié)合元件,作為在ALI中表達(dá)增加的轉(zhuǎn)錄因子,它對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的可能引起了我們的關(guān)注。為了觀察FoxA1是否對ALI所致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用,本研究第二部分首先對ALI大鼠肺組織的caspase3進(jìn)行了檢測,同時對ALI大鼠肺組織切片進(jìn)行了TUNNEL和MNF116免疫組化共染色實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,ALI大鼠肺組織中caspase3活性上調(diào),ALI大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。另一方面,將分離的原代SD大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞以及A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株暴露于H_2O_2誘導(dǎo)細(xì)胞急性損傷,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,發(fā)現(xiàn)H_2O_2導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率顯著上升。 為探討FoxA1在ALI時肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡中的可能作用,我們構(gòu)建了FoxA1過表達(dá)的A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株,并采用反義寡核苷酸技術(shù)建立了內(nèi)源性FoxA1表達(dá)抑制的模型,采用流式細(xì)胞術(shù)觀察FoxA1對H_2O_2所致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,FoxA1過表達(dá)導(dǎo)致H_2O_2所致的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡率上升,而內(nèi)源性FoxA1表達(dá)抑制則導(dǎo)致H_2O_2所致的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡率下降。上述結(jié)果表明FoxA1能促進(jìn)H_2O_2所致的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡。 為深入研究FoxA1調(diào)控肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制,首先采用生物信息學(xué)技術(shù)對凋亡相關(guān)基因啟動子區(qū)進(jìn)行了分析,并采用RT-PCR進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)促凋亡基因bcl2和UCP2可能受到FoxA1的調(diào)控。然后,本研究進(jìn)一步觀察了FoxA1對這兩個基因表達(dá)的影響,并對其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探討,獲得了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)FoxA1對H_2O_2刺激下bcl2和UCP2 mRNA表達(dá)具有抑制作用。H_2O_2刺激后,bcl2和UCP2的mRNA表達(dá)明顯升高;FoxA1過表達(dá)明顯抑制了H_2O_2誘導(dǎo)的bcl2和UCP2 mRNA的表達(dá);而FoxA1內(nèi)源性抑制則促進(jìn)bcl2和UCP2 mRNA表達(dá)。(2)FoxA1抑制H_2O_2所致bcl2和UCP2蛋白質(zhì)的表達(dá)。H_2O_2刺激后,bcl2和UCP2的蛋白表達(dá)明顯升高;FoxA1過表達(dá)明顯抑制了H_2O_2誘導(dǎo)的bcl2和UCP2蛋白的表達(dá);而FoxA1內(nèi)源性抑制則促進(jìn)bcl2和UCP2蛋白的表達(dá)。(3)H_2O_2促進(jìn)FoxA1與bcl2和UCP2基因啟動子區(qū)的結(jié)合活性。在正常狀態(tài)下FoxA1能夠與bcl2基因啟動子區(qū)-538～-532bp、-280～-272bp和UCP2基因啟動子區(qū)-919～-913bp結(jié)合,H_2O_2能夠促進(jìn)此結(jié)合活性的增強(qiáng)。(4)FoxA1能抑制H_2O_2所致bcl2和UCP2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)。FoxA1能夠抑制正常狀態(tài)下bcl2和UCP2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,并明顯抑制H_2O_2所致的bcl2和UCP2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)。上述結(jié)果表明,FoxA1通過抑制抗凋亡基因bcl2和UCP2的表達(dá)而促進(jìn)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡,可能在ALI所致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了FoxA1的一個新功能,即FoxA1在ALI大鼠肺組織及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),FoxA1通過與促凋亡基因bcl2和UCP2啟動子區(qū)的FoxA1結(jié)合元件相結(jié)合來抑制其表達(dá),從而促進(jìn)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡,在ALI中發(fā)揮作用。 上述研究揭示了FoxA1在ALI所致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡中的作用,為揭示ALI的發(fā)病機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為深入探討FoxA1的生物學(xué)功能和ALI的防治提供了新的線索。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R563.8
【圖文】：

助Haa Ctrl0.shlhZh4hsh16h24h圖1一1.ALI大鼠血?dú)夥治?A)sD大鼠尾靜脈注射oA(0.lml/kg)后不同時間點(diǎn)pao:和PaeoZ變化;(B)sn大鼠

為探討AU時FoxAI在肺組織中的表達(dá)情況，我們采用Rl’ -PCR和Westemblot分別檢測了上述三種SD大鼠ALI模型中肺組織的 FoxAImRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。圖1一3結(jié)果顯示 :FoxAImRNA水平在三種ALI模型中均顯著升高;與mRNA表達(dá)情況一致，F(xiàn)oxAI蛋白表達(dá)亦呈上升趨勢。然而，三種ALI模型中FoxAI表達(dá)增高開始的時間并不一致。OA尾靜脈注射和LPS氣管內(nèi)滴注后分別于0.5和2小時FoxAlmRNA和蛋白質(zhì)即開始出現(xiàn)表達(dá)增高，上升趨勢維持至24小時(圖l一3A，l一3B，l一3E，l一3F)。而LPS腹腔注射所致SD大鼠ALI時，F(xiàn)oxAI表達(dá)上升出現(xiàn)的時間較OA組晚

別檢測FoxAI的表達(dá)變化。結(jié)果表明與原代分離大鼠肺泡fl型上皮細(xì)胞相似，LPS、HZOZ、飛NF一a刺激1一2小時后A549細(xì)胞中 FoxAImRNA表達(dá)明顯上升，上升趨勢維持至24小時(圖1一SA，1一SC，1一SE);與mRNA表達(dá)情況一致，A549

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 戴文娟;機(jī)械性創(chuàng)傷誘發(fā)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號：2789137