發(fā)布時間：2020-08-09 14:27

【摘要】：背景:大氣細顆粒物(PM)是由多種成分組成的復(fù)雜混合物,包括酸,有機化學(xué)物,金屬,土壤或灰塵顆粒。它的吸入會導(dǎo)致呼吸道癥狀的惡化,藥物使用頻繁,肺功能下降,氣道損傷以及死亡率的增加。然而目前仍未有藥物可以保護PM介導(dǎo)的氣道損傷。已有研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬在PM介導(dǎo)的氣道損傷中起關(guān)鍵作用。細胞自噬是PM誘導(dǎo)氣道炎癥及黏液高分泌所必需的并且是通過NF-κB以及AP-1(activator protein 1)通路起作用。因此,我們認為自噬抑制劑(Spautin-1以及3-Methyladenine,3-MA)可能是治療PM誘導(dǎo)的氣道損傷的有效方法,可能為PM相關(guān)的氣道損傷提供新的預(yù)防和/或保護途徑。目的:本課題擬探討自噬抑制劑(Spautin-1以及3-MA)是否能抑制PM誘導(dǎo)的急性氣道炎癥,并探索可能的機制。方法:在PM干預(yù)過的人體氣道上皮細胞HBE(human bronchial epithelial cells)中分別加入自噬抑制劑(Spautin-1和3-MA),利用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot,WB)檢測PM誘導(dǎo)的細胞自噬并檢測NF-κB通路相關(guān)蛋。同時利用Q-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)檢測分別干預(yù)自噬抑制劑(Spautin-1 或3-MA)以及PM后HBE炎癥因子的表達。在體內(nèi)研究中,將6-8周雄性C57BL/6小鼠隨機分為4組,第一組為生理鹽水對照組(NS組),第二組為單純給藥組(Spautin-1或3-MA),第三組為單純PM干預(yù)組,第四組為PM+給藥組(PM+Spautin-1或PM+3-MA)。于PM最后一次干預(yù)24小時后處死小鼠,予小鼠肺泡灌洗3次,取小鼠肺泡灌洗液用光學(xué)顯微鏡觀察炎癥細胞總數(shù)及甩片染色后記錄中性粒細胞比例及絕對值,肺組織用Q-PCR及ELISA檢測炎癥因子的表達,肺組織病理HE染色觀察氣道周圍炎癥浸潤的情況。結(jié)果:(1)體外實驗證明在同時加入自噬抑制劑(Spautin-1或3-MA)和PM干預(yù)后的HBE細胞,炎癥因子IL-6,IL-8的表達比單純干預(yù)PM的HBE細胞要低,并且NF-κB通路相關(guān)蛋白p65和p-p65表達也降低。(2)體內(nèi)實驗證明自噬抑制劑(Spautin-1和3-MA)能緩解PM滴注后小鼠氣道炎癥,肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)及中性粒細胞比例及絕對值明顯減少,肺組織炎癥因子顯著降低,氣道周圍炎癥浸潤明顯緩解。結(jié)論:細胞自噬抑制劑(Spautin-1和3-MA)可以通過NF-κB通路有效緩解大氣顆粒物(PM)誘導(dǎo)的氣道炎癥�？赡転镻M相關(guān)的氣道損傷提供新的保護方法。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X513;R56
【圖文】：

我們用不同濃度梯度的ＰＭ干預(yù)ＨＢＥ細胞，在干預(yù)后２４ｈ收樣，用ＷＢ檢測細逡逑胞自噬ｍａｒｋｅｒＬＣ３以及ｐ６２的表達。我們發(fā)現(xiàn)ＬＣ３隨ＰＭ干預(yù)濃度的增加而表達逡逑增加，而ｐ６２隨ＰＭ干預(yù)濃度的增加而表達降低（圖３．１），綜上所述說明了隨著ＰＭ逡逑干預(yù)濃度的增加，細胞自噬水平增加。另外，我們用同樣濃度的ＰＭ干預(yù)ＨＢＥ細逡逑胞，發(fā)現(xiàn)細胞自噬水平隨著干預(yù)時間的增加而增加（圖３．２）。于此同時，透射電鏡逡逑觀察ＰＭ（１０（Ｖｇ／只）氣道滴注２天后小鼠支氣管的氣道上皮細胞，發(fā)現(xiàn)相較于生理逡逑鹽水組（ＮＳ組），自噬小體的數(shù)量明顯增加（圖３．３）。因此，以上結(jié)果提示ＰＭ能逡逑誘導(dǎo)人氣道上皮ＨＢＥ細胞以及小鼠氣道上皮細胞自噬水平的增加。逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋０邐２５邐５０邐１００逡逑（（＿ｔｇ／ｍｌ）邐邐逡逑ＬＣ３Ｉ邐＾————逡逑ＬＣ３１１邐一—邐—邐邐邐丨丨．．Ｔ逡逑邐邋…１．１．１．．．．．１邋＂邋．．邋＋邋？邋邋邐＿邋｜邋邋逡逑ｐ６２邐丨}0栜逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ邐邐邋＿丨爹邋＿＿＿＿＿＿川丨丨一邋＿丨１邋－爹逡逑圖３．１細胞自噬隨著ＰＭ干預(yù)濃度的增加而增加。用卩叼（０，２５，５０，１００呢／0１１）干預(yù)逡逑ＨＢＥ細胞２４ｈ，提取細胞總蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測ＬＣ３以及ｐ６２的表達。以（３－ａｃｔｉｎ逡逑為內(nèi)參。逡逑２１逡逑

邐１１５００＊逡逑ｒ邋１逡逑圖３．３體內(nèi)實驗中，氣道滴注ＰＭ后小鼠氣道上皮細胞中自噬小體的數(shù)量明顯增加。逡逑ＰＭ氣道滴注２天后取小鼠氣管處理后，透射電鏡觀察小鼠支氣管氣道上皮細胞，逡逑發(fā)現(xiàn)相較于ＮＳ組，ＰＭ實驗組自噬小體的數(shù)量明顯增加。逡逑２２逡逑

－逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑圖３．２細胞自噬隨著ＰＭ干預(yù)時間的增加而增加。用ＰＭ（１００ｐｇ／ｍｌ）干預(yù)ＨＢＥ細胞逡逑（０，８，１６，２４ｈ），提取細胞總蛋白，ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ檢測ＬＣ３以及ｐ６２的表達。以ｐ－ａｃｔｍ逡逑為內(nèi)參。逡逑８３００＊邐１１５００＊逡逑ｒ邋１逡逑圖３．３體內(nèi)實驗中，氣道滴注ＰＭ后小鼠氣道上皮細胞中自噬小體的數(shù)量明顯增加。逡逑ＰＭ氣道滴注２天后取小鼠氣管處理后，透射電鏡觀察小鼠支氣管氣道上皮細胞，逡逑發(fā)現(xiàn)相較于ＮＳ組，ＰＭ實驗組自噬小體的數(shù)量明顯增加。逡逑２２逡逑

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本文編號：2787243