【摘要】： 支氣管哮喘是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,在臨床上常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、呼吸困難等,受遺傳因素和環(huán)境因素間復(fù)雜的相互作用而發(fā)病。近幾十年來,隨著工業(yè)化的進(jìn)展和環(huán)境的改變,哮喘發(fā)病率和死亡率在大多數(shù)國家呈上升的趨勢(shì)。家系和雙子研究反映出哮喘發(fā)病有很強(qiáng)的個(gè)體遺傳特質(zhì)。使用定位克隆技術(shù)和候選基因的方法,發(fā)現(xiàn)人類多個(gè)染色體的不同區(qū)域及多個(gè)候選基因與哮喘發(fā)病相關(guān),其中就有位于人類染色體5q31-33區(qū)的TIM-4基因、IL-4基因、IL-13基因、CD14基因,位于染色體16p11-12區(qū)的IL-4Ra基因,以及位于12q14-24區(qū)的STAT6基因。研究表明,Th1/Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子失衡在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著主要的作用,而哮喘通常被認(rèn)為是一種Th2型疾病。TIM-4基因是新近發(fā)現(xiàn)的TIM基因家族中一員,與TIM-1結(jié)合后可提供一個(gè)協(xié)同刺激信號(hào)介導(dǎo)Th2細(xì)胞的增殖與分化。IL-4,IL-13已被認(rèn)為是傳統(tǒng)的哮喘易感基因,國內(nèi)外多篇文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于其基因多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)性研究,但結(jié)果卻未能得到統(tǒng)一。IL-4Ra基因是IL-4α,IL-13基因受體的共同組成部分,STAT6基因是IL-4／IL-13通路執(zhí)行生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄激活因子,兩者同樣在哮喘的發(fā)病中起著重要的作用。CD14基因位于哮喘易感區(qū)5q31.1,有報(bào)道稱位于啟動(dòng)子區(qū)的-C159T突變與兒童哮喘及成人高IgE相關(guān)。因?yàn)橄且环N復(fù)雜的多基因性疾病,因此研究多個(gè)基因之間的交互作用對(duì)哮喘發(fā)病的影響是十分必要的。雖然上述6個(gè)基因的多態(tài)性位點(diǎn)在一些人群中報(bào)道與哮喘具有相關(guān)性,但其基因間的交互作用與哮喘的關(guān)聯(lián)卻研究甚少,因此我們研究其基因的交互作用對(duì)哮喘的影響可能會(huì)對(duì)哮喘的發(fā)病機(jī)理帶來新的認(rèn)識(shí)。一般來說,在疾病的關(guān)聯(lián)研究中,如果僅僅只使用常規(guī)的病例對(duì)照研究可能由于人群分層的影響而帶來假陽性／假陰性結(jié)果,因此,我們采取病例對(duì)照和家系對(duì)照相結(jié)合的方法,避免這些不利的影響,從而能更加嚴(yán)格地說明其基因多態(tài)性與哮喘的相關(guān)關(guān)系。 本課題我們首先探討了以CRS-RFLP法研究TIM-4基多態(tài)性與支氣管哮喘的相關(guān)關(guān)系,同時(shí)也是基于CRS-RFLP方法學(xué)的建立。然后基于CRS-RFLP的基礎(chǔ)上,使用病例對(duì)照研究了IL-4, IL-13, IL-4Rα, STAT6, CD14基因共8個(gè)SNPs的單個(gè)SNP及單倍型與支氣管哮喘的關(guān)系,同時(shí),運(yùn)用MDR方法來分析其基因交互作用與哮喘的相關(guān)關(guān)系。最后我們使用核心家系資料,利用單個(gè)SNP、單倍型的關(guān)聯(lián)研究,以及基于家系的基因交互作用來探討上述5個(gè)哮喘候選基因的的8個(gè)SNPs與中國中部地區(qū)漢族人群支氣管哮喘及血清總IgE的相關(guān)關(guān)系。本研究共分為如下的三個(gè)部分： 第一部分 運(yùn)用CRS-RFLP法研究TIM-4基多態(tài)性與支氣管哮喘的相關(guān)關(guān)系 目的探討T細(xì)胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白-4 (T cells immunoglobulin domain and mucin domain protein-4, TIM-4)基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)、外顯子3區(qū)Val172Met(G/A)、外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與中國中部地區(qū)漢族人群支氣管哮喘及其表型的相關(guān)關(guān)系。 方法采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)-限制性片段長度多態(tài)性(CRS-RFLP)的方法對(duì)中國中部地區(qū)185例哮喘患者和162例健康者TIM-4基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)、外顯子3區(qū)Val172Met(G/A)、外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)的多態(tài)性進(jìn)行分析,計(jì)算基因型和等位基因頻率,并比較其在兩組中的差異。采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清總IgE含量,比較其在哮喘患者不同基因型之間的差異。 結(jié)果(1)TIM-4基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)位點(diǎn)GG、GA基因型頻率,G、A等位基因頻率在哮喘組和對(duì)照組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),本位點(diǎn)在中國中部地區(qū)漢族人群共347個(gè)標(biāo)本中未檢測(cè)到AA基因型。(2)本試驗(yàn)在中國中部地區(qū)漢族人群共347個(gè)標(biāo)本中未檢測(cè)到TIM-4外顯子3區(qū)Val172Met(G/A)的多態(tài)性,所有標(biāo)本均為GG型。(3)本試驗(yàn)在中國中部地區(qū)漢族人群共347個(gè)標(biāo)本中未檢測(cè)到TIM-4外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)的多態(tài)性,所有標(biāo)本均為GG型。(4)哮喘組血清總IgE含量在外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)位點(diǎn)不同基因型間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論TIM-4基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)存在單核苷酸多態(tài)性變異,但該位點(diǎn)的變異與中國中部地區(qū)漢族人群支氣管哮喘易感性及其表型血清總IgE水平無關(guān)；TIM-4基因外顯子3區(qū)Val172Met(G/A)、外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)在中國中部地區(qū)漢族人群中未發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性。 第二部分 IL-4, IL-13, IL-4Rα, STAT6, CD14基因多態(tài)性的單個(gè)SNP及其基因交互作用與支氣管哮喘的相關(guān)性研究 目的探討IL-4 -C33T, IL-4 -C589T, IL-13 R130Q, IL-13 C1923T, IL-4Ra I75V, IL-4Ra Q576R, CD14-C159T, STAT6 C2892T多態(tài)性位點(diǎn)：1).單個(gè)SNP：2).IL-4,IL-13,IL-4Ra基因單倍型；3).上述8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因交互作用與中國中部地區(qū)漢族兒童哮喘的相關(guān)性。 方法采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)-限制性片段長度多態(tài)性(CRS-RFLP)的方法對(duì)中國中部地區(qū)252例哮喘兒童和227例健康兒童共479名兒童IL-4 -C33T, IL-4 -C589T, IL-13 R130Q, IL-13 C1923T, IL-4RαI75V, IL-4Ra Q576R, CD14-C159T, STAT6 C2892T的多態(tài)性進(jìn)行分析。使用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算單個(gè)SNP與哮喘的相關(guān)關(guān)系；使用SHEsis在線軟件對(duì)IL-4,IL-13,IL-4Ra基因分別進(jìn)行單倍型分析；使用多因子降維法(MDR)檢測(cè)8個(gè)SNPs之間的基因交互作用與哮喘的相關(guān)關(guān)系。 結(jié)果8個(gè)SNP中僅IL-13 R130Q和IL-13 c1923T位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在哮喘兒童與健康兒童間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-13 R130Q位點(diǎn)的A等位基因和IL-13 C1923T位點(diǎn)的T等位基因具有較高的哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.59,95%CI1.20-2.09；OR=1.57,95%CI 1.19-2.08)。其余6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的單個(gè)SNP與哮喘無相關(guān)性。通過單倍型分析,由C1923T和R130Q構(gòu)成的IL-13基因單倍型中,C-G和T-A單倍型與兒童哮喘顯著相關(guān)(P0.05)。由175V和Q576R構(gòu)成的IL-4Ra基因單倍型中,G-A和A-A單倍型與兒童哮喘具有相關(guān)性(P0.05)。由-C33T和-C589T構(gòu)成的IL-4基因單倍型中,未檢測(cè)到與哮喘顯著相關(guān)的單倍型。通過MDR分析,我們檢測(cè)到由IL-4 -C33T, IL-13 R130Q, IL-4RαI75V, IL-4RαQ576R, STAT6 C2892T, CD14-C159T 6個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)成的最佳基因交互模型,具有潛在的哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=4.43,95%CI 1.30-15.04；P0.001,通1000次排列檢驗(yàn))。 結(jié)論IL-13基因多態(tài)性單個(gè)SNP及其單倍型與中國中部地區(qū)兒童哮喘的易感性相關(guān),提示IL-13在哮喘的發(fā)病中起著重要作用。IL-4Ra基因單倍型與哮喘具有關(guān)聯(lián)興,提示IL-4Ra可能以單倍型的形式影響哮喘的易感性。由IL-4-C33T, IL-13 R130Q, IL-4RαI75V, IL-4RαQ576R, STAT6 C2892T, CD14-C159T構(gòu)成的基因交互模型可增加中國中部地區(qū)兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)性。 第三部分 基于家系的IL-4, IL-13, IL-4Rα, STAT6, CD14基因多態(tài)性與支氣管哮喘的易感性研究 目的基于核心家系資料基礎(chǔ),探討IL-4 -C33T, IL-4 -C589T, IL-13 R130Q, IL-13 C1923T, IL-4RαI75V, IL-4Ra Q576R, CD14-C159T, STAT6 C2892T各多態(tài)性位點(diǎn)：1).單個(gè)SNP；2).IL-4,IL-13,IL-4Ra基因單倍型；3).上述8個(gè)SNPs位點(diǎn)之間的基因交互作用與中國中部地區(qū)漢族人群支氣管哮喘及其表型的關(guān)系。 方法采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)-限制性片段長度多態(tài)性(CRS-RFLP)的方法對(duì)中國中部地區(qū)126個(gè)核心家系(由一名哮喘患者及其雙親組成)共378名成員IL-4-C33T, IL-4-C589T, IL-13 R130Q, IL-13 C1923T, IL-4RαI75V, IL-4Ra Q576R, CD14-C159T, STAT6 C2892T的多態(tài)性進(jìn)行分析。采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清總IgE含量。采用基于家系的單倍型相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析(HRR)進(jìn)行各單個(gè)SNP與哮喘的傳遞不平衡關(guān)聯(lián)分析。使用FBAT軟件分析單倍型與哮喘之間的關(guān)聯(lián)性,及單個(gè)SNP、單倍型與哮喘表型血清總IgE的相關(guān)性。使用MDR軟件分析上述8個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因交互作用與哮喘易感性的關(guān)系。 結(jié)果經(jīng)單個(gè)SNP與哮喘的HRR分析,各SNP位點(diǎn)與哮喘均無顯著相關(guān)性。經(jīng)FBAT分析,IL-4,1L-13,IL-4Ra各基因單倍型與哮喘均無相關(guān)性。IL-13基因C1923T位點(diǎn)T等位基因和R130Q位點(diǎn)A等位基因與哮喘表型血清總IgE水平相關(guān)(P=0.038；P=0.043)；其中,C1923T的T等位基因和R130Q的A等位基因均具有較高的血清總IgE水平觀察值,是血清高IgE水平的風(fēng)險(xiǎn)因子。由c1923T和R130Q構(gòu)成的IL-13基因單倍型CG及由175V和Q576R構(gòu)成的IL-4Rα基因單倍型AA與血清總IgE水平相關(guān)(P=0.032；P=0.026)。通過MDR分析,我們檢測(cè)到由IL-4-C33T, IL-13 R130Q, IL-4RαI75V, IL-4Ra Q576R, STAT6 C2892T, CD14-C159T 6個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)成的最佳基因交互模型,具有潛在的哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=12.08,95%CI 1.86-78.52；P0.001,通1000次排列檢驗(yàn))。 結(jié)論IL-13基因多態(tài)性以單個(gè)SNP及單倍型形式影響哮喘相關(guān)表型血清總IgE的水平。IL-4Rα基因多態(tài)性以單倍型的形式影響血清IgE的水平。由IL-4-C33T, IL-13 R130Q, IL-4RαI75V, IL-4Ra Q576R, STAT6 C2892T, CD14-C159T構(gòu)成的基因交互作用可增加中國中部地區(qū)漢族人群罹患哮喘的易感性。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R562.25
【圖文】：

華中科技大學(xué)博士學(xué)位小已出膠，在圖中未見)，突變雜合子GA基因型可形成。突變純合子AA基因型不能被酶切，仍為154bP。見圖vitrogen生物技術(shù)公司測(cè)序證實(shí)，見圖2、3。

圖1.3TIM一4外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)位A等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖注:其中下劃線為A等位基因.2TIM~4外顯子3區(qū)vall72Met(GIA)酶切圖譜分析當(dāng)TIM一4基因172位氨基酸是野生型的繳氨酸(GTG)時(shí)，可被Sdul酶切形成9飾，16bP片段(16bP因片段過小在圖中未見)，而當(dāng)突變?yōu)榈鞍彼?ATG)，不能Sdul酶切，仍為185bP。GA雜合子可形成185bP，169飾，16bP片段。本試驗(yàn)所有本的PCR片段均被Sdul酶切斷，即均為GG型，雖沒檢測(cè)到Vall72Met(G/A)突變，同時(shí)也證明了CRS一RFLP是一種實(shí)用可行的方法。酶切圖譜見圖1.4。G等位基因由上海invitrogen生物技術(shù)公司測(cè)序證實(shí)，見圖1.5。

圖1.4TIM一4外顯子3區(qū)vall72Met(o/A)酶切圖譜M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);l、2:GG基因型;3、4:PCR產(chǎn)110G.二TG11…;川川介舊11.日怕日日日ll…，J曰曰曰曰.l洲日日日|lTIM一4外顯子3區(qū)vall72Met(G閃位G等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物

【共引文獻(xiàn)】

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4 王真;楊s

本文編號(hào)：2776282