【摘要】： 目的:建立一套可靠的鼠肺成纖維細(xì)胞分離、純化和培養(yǎng)技術(shù),并研究鼠肺成纖維細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架中的生長(zhǎng)特性,進(jìn)而為體外研究間質(zhì)性肺病的發(fā)病機(jī)制及治療提供一種新的方法。 方法: 1、采用胰酶消化出生后2 d SD大鼠肺組織塊,經(jīng)差時(shí)貼壁法,分離、純化鼠肺成纖維細(xì)胞,并進(jìn)行原代培養(yǎng)。用波形蛋白免疫熒光染色、掃描電鏡和蛋白質(zhì)印跡法對(duì)所分離、純化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,并繪制其生長(zhǎng)曲線。 2、將纖維蛋白原、層粘連蛋白和纖粘連蛋白按一定比例混合后,在新鮮大鼠血漿促凝作用下,構(gòu)建單層毯狀細(xì)胞外基質(zhì)支架。將原代培養(yǎng)并純化傳代的鼠肺成纖維細(xì)胞分別植入支架及加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β_1的支架,應(yīng)用倒置顯微鏡、免疫熒光、掃描電鏡、MTT法、Real-time PCR和免疫印跡方法觀察鼠肺成纖維細(xì)胞在三維培養(yǎng)中的生長(zhǎng)特性。 結(jié)果: 1、該方法所得細(xì)胞產(chǎn)量大、純度高。鼠肺成纖維細(xì)胞免疫熒光染色波形蛋白陽(yáng)性。掃描電鏡觀察可見(jiàn)細(xì)胞有微絨毛,細(xì)胞間連接成網(wǎng)狀。免疫印跡檢測(cè)顯示波形蛋白表達(dá)。生長(zhǎng)曲線提示細(xì)胞增殖穩(wěn)定。 2、鼠肺成纖維細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架及加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β_1的支架中細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化及Ⅰ型膠原、MMP-2、TGF-β_1合成能力均明顯強(qiáng)于普通單層培養(yǎng)。 結(jié)論: 1、該方法是一種可靠的鼠肺成纖維細(xì)胞分離純化培養(yǎng)技術(shù)。 2、鼠肺成纖維細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架中有良好的生長(zhǎng)特性,為體外研究成纖維細(xì)胞在肺間質(zhì)纖維化中的作用提供了一種新的方法。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R563
【圖文】：

2.2.1倒置顯微鏡細(xì)胞形態(tài)觀察原代培養(yǎng)5一7d即有新生細(xì)胞長(zhǎng)出，為成纖維細(xì)胞型，貼壁生長(zhǎng)。初時(shí)細(xì)胞形態(tài)多樣化，但多為類圓形，帶有粗大突起(圖2一la)，分離純化后3d后變?yōu)殚L(zhǎng)梭形、條索狀，融合成片(圖2一lb)，第7天后彼此連接成網(wǎng)狀，分界較為模糊(圖2一Ic)。圖2一 1LF原代培養(yǎng)倒置顯微鏡觀察2.2.2免疫熒光鑒定肺成纖維細(xì)胞vimentin免疫熒光染色陽(yáng)性，即胞漿內(nèi)圍繞細(xì)胞核呈紅色絲狀網(wǎng)絡(luò)形態(tài)，猶如樹(shù)葉的葉脈，陽(yáng)性率在95%以上， Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色(圖2一2)。

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文圖2一 2LF原代培養(yǎng)免疫熒光鑒定A:vimel飛titl陽(yáng)性呈紅色/40)B:核熒光陽(yáng)性呈蘭色/4的2.2.3掃描電鏡鑒定取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成纖維細(xì)胞掃描電鏡示成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞有微絨毛，細(xì)胞間連接成網(wǎng)狀，并分泌膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)(圖2一3)。圖2一 3LF原代培養(yǎng)掃描電鏡鑒定掃描電鏡 x55050tlm2.2.4蛋白質(zhì)印跡法鑒定第3代生長(zhǎng)良好的成纖維細(xì)胞蛋白提取后行蛋自質(zhì)印跡法測(cè)定波形蛋白較強(qiáng)表達(dá)(圖2一4)。......少 VIMENI’!N(玉APDH圖2一4L下了原代培養(yǎng)western一blot鑒定vime;lti:1蛋白表達(dá)2.2.5鼠肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線MTT比色法測(cè)定是個(gè)快速簡(jiǎn)便的顏色反應(yīng)的測(cè)定，活細(xì)胞線粒體中的玻泊酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS綠色的MTT還原成藍(lán)紫色的甲攢，而MTT在死亡細(xì)胞內(nèi)不能

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文圖2一 2LF原代培養(yǎng)免疫熒光鑒定A:vimel飛titl陽(yáng)性呈紅色/40)B:核熒光陽(yáng)性呈蘭色/4的2.2.3掃描電鏡鑒定取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成纖維細(xì)胞掃描電鏡示成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞有微絨毛，細(xì)胞間連接成網(wǎng)狀，并分泌膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)(圖2一3)。圖2一 3LF原代培養(yǎng)掃描電鏡鑒定掃描電鏡 x55050tlm2.2.4蛋白質(zhì)印跡法鑒定第3代生長(zhǎng)良好的成纖維細(xì)胞蛋白提取后行蛋自質(zhì)印跡法測(cè)定波形蛋白較強(qiáng)表達(dá)(圖2一4)。......少 VIMENI’!N(玉APDH圖2一4L下了原代培養(yǎng)western一blot鑒定vime;lti:1蛋白表達(dá)2.2.5鼠肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線MTT比色法測(cè)定是個(gè)快速簡(jiǎn)便的顏色反應(yīng)的測(cè)定，活細(xì)胞線粒體中的玻泊酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS綠色的MTT還原成藍(lán)紫色的甲攢，而MTT在死亡細(xì)胞內(nèi)不能

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2763052