【摘要】：目的肺纖維化是一種進展性的,難以治愈的肺部疾病,以肺部炎癥、成纖維細胞增殖、膠原纖維沉積為特征,并伴有肺部組織結(jié)構(gòu)破壞,嚴(yán)重影響患者的呼吸功能及生存質(zhì)量。因此尋找肺纖維化的治療方法是臨床上一項復(fù)雜而艱巨的任務(wù)。在肺纖維化的病理過程中,由巨噬細胞介導(dǎo)的肺部炎癥促進了肺纖維化的進展。據(jù)相關(guān)文獻報道,在中樞小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞中均有表達的G蛋白偶聯(lián)受體17(G protein-coupled receptor 17,GPR17)可介導(dǎo)腦缺血慢性期炎癥和肺部過敏性炎癥;另一方面,血小板可對組織損傷或感染做出響應(yīng),與中性粒細胞結(jié)合,并促使其趨化至組織損傷部位,進一步增強炎癥水平。目前臨床使用的一種血小板活性抑制劑--坎格雷洛(cangrelor)同時可作為GPR17的非選擇性拮抗劑發(fā)揮作用。因此在本次研究中,我們對坎格雷洛在博來霉素(bleomycin,BLM)誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥及肺纖維化過程中的作用及機制進行探究。方法第一部分我們通過CCK-8實驗測試不同劑量的博來霉素及坎格雷洛對RAW264.7細胞生存率的影響,以確定細胞實驗的最佳給藥劑量;之后通過GPR17 siRNA敲降細胞中的GPR17,探究GPR17是否參與博來霉素誘導(dǎo)的細胞炎癥過程;對博來霉素刺激后的RAW264.7細胞給予不同劑量的坎格雷洛(0-2μg/ml),觀察坎格雷洛是否能夠緩解博來霉素誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥。使用不同劑量的坎格雷洛(2.5 mg/kg-10 mg/kg)對博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化的小鼠進行背部皮下給藥,通過HE染色和Masson染色,觀察小鼠肺部炎癥和肺部膠原沉積情況;對小鼠肺部進行免疫組化染色和免疫熒光染色,統(tǒng)計肺部表達GPR17的CD68陽性巨噬細胞數(shù)量,以確定GPR17在小鼠肺纖維化過程中表達于肺部巨噬細胞;通過Western blot和qRT-PCR檢測小鼠肺部炎癥因子(TNF-α,IL-6和TGF-β1)及GPR17的表達水平,驗證坎格雷洛通過抑制巨噬細胞表達的GPR17而緩解小鼠肺纖維化的設(shè)想。第二部分通過流式細胞術(shù),檢測肺纖維化小鼠外周血和肺泡灌洗液(BALF)的中性粒細胞與血小板的數(shù)量、活化程度及相互結(jié)合情況;通過elisa檢測肺纖維化小鼠血清和肺泡灌洗液中的相關(guān)炎癥因子(PF4,CD40L和MPO)分泌情況,探究血小板和中性粒細胞分泌炎癥因子的水平是否可被坎格雷洛下調(diào);通過肺部免疫組化染色和Western blot,檢測小鼠肺部血小板和中性粒細胞的結(jié)合情況,以及中性粒細胞表達CD40蛋白的水平,驗證坎格雷洛通過抑制血小板-中性粒細胞結(jié)合情況而緩解小鼠肺纖維化的設(shè)想。結(jié)果第一部分1.通過CCK-8實驗確認(rèn),博來霉素(1μg/ml)和坎格雷洛(10 μM)給藥對RAW 264.7細胞的生存率影響較小(P0.05)。2.通過GPR17 siRNA敲降RAW264.7細胞表達的GPR17后,對細胞進行博來霉素處理,細胞分泌的相關(guān)炎癥因子水平較低,說明GPR17介導(dǎo)博來霉素誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥。3.對博來霉素刺激后的RAW264.7細胞給予不同劑量的坎格雷洛(0-2μg/ml),細胞分泌的相關(guān)炎癥因子水平(TNF-α,IL-6,TGF-β1)相比于博來霉素處理組顯著下調(diào)。4.對小鼠肺部進行HE染色和Masson染色,發(fā)現(xiàn)使用不同劑量(2.5 mg/kg-10 mg/kg)的坎格雷洛對肺纖維化小鼠給藥,小鼠肺部炎癥,組織破壞情況和肺部膠原沉積情況顯著減輕,肺部纖維化評分下降(6.17±0.98 for BLM vs 4.33±0.82 for BLM+Cang 2.5 mg/kg;4±0.63 for BLM+Cang 5 mg/kg;2.67±0.82 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001),呈藥物濃度依賴性。5.對小鼠肺部進行免疫組化染色和免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)坎格雷洛給藥后,小鼠肺部 GPR17陽性細胞數(shù)量(65.83±6.62 for BLM vs 32.17±3.87 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001)和 CD68 陽性巨噬細胞數(shù)量(66.67±7.23 for BLM vs 36.17±5.98 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001)均顯著下降,同時 GPR17 陽性細胞和CD68陽性巨噬細胞在免疫熒光染色中出現(xiàn)共定位。6.通過qRT-PCR和Westem blot,發(fā)現(xiàn)肺纖維化小鼠產(chǎn)生的相關(guān)炎癥因子(TNF-α,IL-6,TGF-β1)轉(zhuǎn)錄水平及分泌水平在坎格雷洛給藥后均顯著下降。第二部分1.取肺纖維化小鼠的外周血和肺泡灌洗液(BALF)進行流式分選,發(fā)現(xiàn)外周血中的中性粒細胞數(shù)量與血小板數(shù)量在坎格雷洛處理后均顯著下降;血小板活化程度(CD62P+/CD41+比值)(0.74±0.13 for BLM vs 0.57±0.09 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.05)以及血小板-中性粒細胞結(jié)合比例(CD41/Ly-6G雙陽性細胞數(shù)量)(7.27±0.72 for BLM vs 3.64±1.86 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.01)均降低。肺泡灌洗液結(jié)果趨勢相近。2.通過elisa檢測肺纖維化小鼠的外周血和肺泡灌洗液(BALF)發(fā)現(xiàn),由中性粒細胞和血小板產(chǎn)生的相關(guān)炎癥因子(PF4,CD40L,MPO)分泌水平在坎格雷洛給藥后均顯著下調(diào)。3.通過肺部免疫組化染色和Western blot,觀察到肺纖維化小鼠的中性粒細胞與CD40的共定位(MPO/CD40比值)在坎格雷洛給藥后無明顯變化(P0.05),而 CD40 陽性細胞數(shù)量(301.3 ± 9.33 for BLM vs 225.0 ± 9.94 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001)和 MPO陽性細胞數(shù)量(252.9±18.45 for BLM vs 147.4±11.01 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001)顯著減少;同時 CD40 蛋白表達水平下調(diào)(189.4±47.21 for BLM vs 159.1±31.29 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001)。結(jié)論坎格雷洛作為GPR17的非選擇性拮抗劑,在RAW264.7巨噬細胞系中下調(diào)博來霉素誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥水平,在小鼠肺纖維化模型中抑制GPR17陽性巨噬細胞數(shù)量上調(diào);另一方面,坎格雷洛可作為血小板活性抑制劑發(fā)揮作用,通過減少血小板-中性粒細胞結(jié)合,抑制CD40-CD40L通路介導(dǎo)的中性粒細胞活化聚集,下調(diào)肺部炎癥水平。綜上所述,我們推測坎格雷洛可通過拮抗GPR17介導(dǎo)的巨噬細胞炎癥,以及抑制血小板與中性粒細胞的活化和趨化作用,緩解博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥及肺纖維化。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R563
【圖文】：

中起作用逡逑我們用不同劑量的博來霉素（0－２ｐｇ／ｍｌ）對小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬細胞進行處逡逑理，通過ＣＣＫ－８試劑盒檢測小鼠ＲＡＷ邋２６４．７巨噬細胞的生存率（圖２．１），可以逡逑觀察到劑量為２［ｉｇ／ｍｌ的博來霉素處理細胞對其生存率影響較大（１００％士邋１３．２％邋ｆｏｒ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｖｓ邋７０．８％邋土邋１４．６％邋ｆｏｒ邋２邋｜ｉｇ／ｍＬ邋ＢＬＭ，邋Ｐ邋＜邋０．０１），因此我們選取劑量為邋１邋ｐｇ／ｍｌ逡逑的博來霉素作為常規(guī)細胞給藥劑量。接下來我們用ＧＰＲ１７ｓｉＲＮＡ處理細胞，以抑逡逑制胞內(nèi)ＧＰＲ１７表達，提取巨噬細胞的ｍＲＮＡ，通過ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測ＧＰＲ１７在胞內(nèi)逡逑的轉(zhuǎn)錄水平（圖２．２），發(fā)現(xiàn)劑量為１邋ｐｇ／ｍｌ的博來霉素處理巨噬細胞后，ＧＰＲ１７逡逑轉(zhuǎn)錄水平顯著上升；用ＧＰＲ１７ｓｉＲＮＡ單獨處理細胞后，細胞內(nèi)ＧＰＲ１７ｍＲＮＡ轉(zhuǎn)逡逑錄水平降低，用ＧＰＲ１７ｓｉＲＮＡ和博來霉素先后處理細胞，ＧＰＲ１７的轉(zhuǎn)錄水平仍保逡逑持較低水平。我們繼續(xù)通過Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＧＰＲ１７在胞內(nèi)的蛋白表達量（圖２．２），逡逑由圖可知ＧＰＲ１７蛋白表達量與ｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄結(jié)果趨勢相近。以上結(jié)果提示ＧＰＲ１７逡逑可能在博來霉素誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥過程中起作用。逡逑１２０ｎ逡逑＾１00．Ｘ邋＾邋Ｔ邋Ｘ逡逑＿ｌｌｉｉ逡逑０邐０．１邐０．２５邐０．５邐１邐２

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本文編號：2761851