本文關鍵詞：微囊藻毒素-LR誘導人支氣管上皮細胞凋亡及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：MCs是藍藻生長過程中釋放的代謝產(chǎn)物，是一組具有生物活性的單環(huán)七肽化合物，是對人類及動物健康威脅最大的一種細胞內(nèi)毒素。MCs性質(zhì)穩(wěn)定，常規(guī)飲用水物理及化學凈化處理措施很難將其有效清除。藻毒素從破裂的藻細胞中釋放到水體中,可經(jīng)過口腔攝入、肺部呼吸、皮膚接觸以及血液滲透等不同的途徑給人類及動物健康造成威脅。有文獻報道藍藻毒素可能會由于水體泡沫以及娛樂過程中產(chǎn)生的浪花等通過肺部呼吸進入到人體，從而可能會引起呼吸系統(tǒng)疾病。 目的 本實驗通過建立穩(wěn)定的微囊藻毒素-LR(Microcystins-LR, MC-LR)染毒人支氣管上皮（Human Bronchial Epithelial,16HBE）細胞研究模型，觀察MC-LR對16HBE細胞的毒性凋亡作用及凋亡相關蛋白、線粒體途徑相關分子表達的影響，旨在闡明MC-LR誘導16HBE細胞的凋亡作用及其可能機制。 方法 1.人支氣管上皮細胞活性的測定采用MTT法檢測MC-LR對16HBE細胞活性的影響，并找出半數(shù)有效濃度（EC50），為后續(xù)實驗選擇毒素濃度提供依據(jù)。 2.活性氧測定采用2,7-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)法測定16HBE細胞中ROS含量。 3.線粒體膜電位測定JC-1染色法結合流式細胞儀測定熒光強度。 4.細胞凋亡率的測定膜聯(lián)蛋白V 異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)雙染色結合流式細胞術檢測。 5. Caspase抑制劑(z-Val-Ala-Asp(O-methyl)-fluoromethylketone, Z-VAD-FMK）以及Z-VAD-FMK和MC-LR聯(lián)合暴露分別對16HBE細胞活性影響的測定MTT方法檢測活性并找出在后續(xù)試驗中Z-VAD-FMK的濃度。 6. Western blot檢測Caspase-3, Caspase-9, Cyt-c, Bcl-2及Bax蛋白表達量。 結果 1. MC-LR(0,1,10,20,30及40μg/ml)處理16HBE細胞24h后，結果顯示隨著MC-LR濃度的升高，16HBE細胞的活性逐漸降低。且1,10,20,30及40μg/ml染毒組細胞活性與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.當暴露時間一定時，隨著MC-LR濃度的升高，16HBE細胞內(nèi)ROS的含量呈上升趨勢。當MC-LR濃度分別為5,10μg/ml時，ROS含量隨著暴露時間的增加而增加，差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.當MC-LR濃度為10μg/ml時，不管作用于細胞24h或48h時，與對照組相比，線粒體膜電位均呈下降趨勢；且差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4. MC-LR(2.5,5,10μg/ml)處理16HBE細胞24h后，細胞凋亡率分別為6.03%、17.90%、26.10%。當暴露48h后，細胞凋亡率分別為19.40%、23.80%、32.23%。 5. Caspase抑制劑單獨作用時，與對照組相比，當Z-VAD-FMK濃度大于100μM時，細胞活性均降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。當抑制劑與毒素聯(lián)合作用時，當MC-LR濃度分別為5,10μg/ml，加入的Z-VAD-FMK濃度為10μg/ml時，與未加Z-VAD-FMK組相比，細胞活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 6. Western blot結果顯示：暴露于MC-LR24h后，與對照相比，Caspase-3,Caspase-9, Cyt-c及Bax相對表達量升高,而Bcl-2的相對表達量降低，且差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。MC-LR作用于16HBE細胞48h時，各目的蛋白相對表達量的變化趨勢與MC-LR作用24h基本一致。MC-LR暴露于16HBE細胞相同濃度時，Bcl-2相對表達量隨暴露時間的增加而降低，其余各蛋白相對表達量增加，具有時間依賴關系。 7.加入caspase抑制劑Z-VAD-FMK預處理后，與不加組相比，，細胞凋亡率明顯減少，Caspase-3和Caspase-9的蛋白相對表達量降低，且差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論 1. MC-LR能導致16HBE細胞發(fā)生凋亡。 2. MC-LR誘導16HBE細胞凋亡的可能機制是線粒體Caspase依賴性途徑。
【關鍵詞】：微囊藻毒素-LR 人支氣管上皮細胞 凋亡機制
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R562
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目錄9-11
• 圖表清單11-12
• 縮略詞表12-13
• 1 前言13-16
• 2 材料與方法16-26
• 2.1 細胞株16
• 2.2 實驗儀器及試劑16-17
• 2.3 主要試劑配制17-19
• 2.4 實驗方法19-25
• 2.4.1 MC-LR 對 16HBE 細胞活性的測定19-20
• 2.4.2 16HBE 細胞中 ROS 的測定20-21
• 2.4.3 16HBE 細胞中線粒體膜電位（MMP）的測定21
• 2.4.4 Caspase 抑制劑 Z-VAD-FMK 對細胞活性的影響21-22
• 2.4.5 加入 Z-VAD-FMK 預處理，MC-LR 對 16HBE 細胞活性的影響22
• 2.4.6 MC-LR 對 16HBE 細胞凋亡率的測定22
• 2.4.7 MC-LR 對 16HBE 細胞線粒體途徑相關分子的測定22-25
• 2.5 統(tǒng)計分析方法25-26
• 3 實驗結果26-39
• 3.1 MC-LR 對 16HBE 細胞活性的影響26-27
• 3.2 不同濃度的 MC-LR 對 16HBE 細胞內(nèi) ROS 的影響27-28
• 3.3 不同濃度的 MC-LR 對 16HBE 細胞線粒體膜電位的影響28-29
• 3.4 Caspase 抑制劑 Z-VAD-FMK 對細胞活性的影響29-30
• 3.5 加入 Z-VAD-FMK 預處理后 MC-LR 對細胞活性的影響30-31
• 3.6 不同濃度 MC-LR 對 16HBE 細胞凋亡率的影響31-33
• 3.7 MC-LR 對 16HBE 細胞中凋亡相關蛋白表達的影響33-35
• 3.8 MC-LR 對 16HBE 細胞中線粒體途徑中相關分子表達的影響35-39
• 4 討論39-43
• 4.1 細胞模型的建立39
• 4.2 MC-LR 對 16HBE 細胞活性及凋亡的影響39-40
• 4.3 ROS 參與 MC-LR 誘導 16HBE 細胞凋亡的調(diào)節(jié)40-41
• 4.4 MC-LR 對 16HBE 細胞中凋亡相關蛋白的影響41
• 4.5 MC-LR 對 16HBE 細胞中線粒體途徑相關蛋白的影響41-43
• 5 結論43-44
• 參考文獻44-48
• 綜述48-63
• 參考文獻57-63
• 個人簡歷63-64
• 致謝64

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：微囊藻毒素-LR誘導人支氣管上皮細胞凋亡及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：272896