本文關(guān)鍵詞：微囊藻毒素-LR誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：MCs是藍(lán)藻生長(zhǎng)過程中釋放的代謝產(chǎn)物，是一組具有生物活性的單環(huán)七肽化合物，是對(duì)人類及動(dòng)物健康威脅最大的一種細(xì)胞內(nèi)毒素。MCs性質(zhì)穩(wěn)定，常規(guī)飲用水物理及化學(xué)凈化處理措施很難將其有效清除。藻毒素從破裂的藻細(xì)胞中釋放到水體中,可經(jīng)過口腔攝入、肺部呼吸、皮膚接觸以及血液滲透等不同的途徑給人類及動(dòng)物健康造成威脅。有文獻(xiàn)報(bào)道藍(lán)藻毒素可能會(huì)由于水體泡沫以及娛樂過程中產(chǎn)生的浪花等通過肺部呼吸進(jìn)入到人體，從而可能會(huì)引起呼吸系統(tǒng)疾病。 目的 本實(shí)驗(yàn)通過建立穩(wěn)定的微囊藻毒素-LR(Microcystins-LR, MC-LR)染毒人支氣管上皮（Human Bronchial Epithelial,16HBE）細(xì)胞研究模型，觀察MC-LR對(duì)16HBE細(xì)胞的毒性凋亡作用及凋亡相關(guān)蛋白、線粒體途徑相關(guān)分子表達(dá)的影響，旨在闡明MC-LR誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的凋亡作用及其可能機(jī)制。 方法 1.人支氣管上皮細(xì)胞活性的測(cè)定采用MTT法檢測(cè)MC-LR對(duì)16HBE細(xì)胞活性的影響，并找出半數(shù)有效濃度（EC50），為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇毒素濃度提供依據(jù)。 2.活性氧測(cè)定采用2,7-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)法測(cè)定16HBE細(xì)胞中ROS含量。 3.線粒體膜電位測(cè)定JC-1染色法結(jié)合流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。 4.細(xì)胞凋亡率的測(cè)定膜聯(lián)蛋白V 異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。 5. Caspase抑制劑(z-Val-Ala-Asp(O-methyl)-fluoromethylketone, Z-VAD-FMK）以及Z-VAD-FMK和MC-LR聯(lián)合暴露分別對(duì)16HBE細(xì)胞活性影響的測(cè)定MTT方法檢測(cè)活性并找出在后續(xù)試驗(yàn)中Z-VAD-FMK的濃度。 6. Western blot檢測(cè)Caspase-3, Caspase-9, Cyt-c, Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)量。 結(jié)果 1. MC-LR(0,1,10,20,30及40μg/ml)處理16HBE細(xì)胞24h后，結(jié)果顯示隨著MC-LR濃度的升高，16HBE細(xì)胞的活性逐漸降低。且1,10,20,30及40μg/ml染毒組細(xì)胞活性與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.當(dāng)暴露時(shí)間一定時(shí)，隨著MC-LR濃度的升高，16HBE細(xì)胞內(nèi)ROS的含量呈上升趨勢(shì)。當(dāng)MC-LR濃度分別為5,10μg/ml時(shí)，ROS含量隨著暴露時(shí)間的增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.當(dāng)MC-LR濃度為10μg/ml時(shí)，不管作用于細(xì)胞24h或48h時(shí)，與對(duì)照組相比，線粒體膜電位均呈下降趨勢(shì)；且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4. MC-LR(2.5,5,10μg/ml)處理16HBE細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率分別為6.03%、17.90%、26.10%。當(dāng)暴露48h后，細(xì)胞凋亡率分別為19.40%、23.80%、32.23%。 5. Caspase抑制劑單獨(dú)作用時(shí)，與對(duì)照組相比，當(dāng)Z-VAD-FMK濃度大于100μM時(shí)，細(xì)胞活性均降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。當(dāng)抑制劑與毒素聯(lián)合作用時(shí)，當(dāng)MC-LR濃度分別為5,10μg/ml，加入的Z-VAD-FMK濃度為10μg/ml時(shí)，與未加Z-VAD-FMK組相比，細(xì)胞活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 6. Western blot結(jié)果顯示：暴露于MC-LR24h后，與對(duì)照相比，Caspase-3,Caspase-9, Cyt-c及Bax相對(duì)表達(dá)量升高,而Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。MC-LR作用于16HBE細(xì)胞48h時(shí)，各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與MC-LR作用24h基本一致。MC-LR暴露于16HBE細(xì)胞相同濃度時(shí)，Bcl-2相對(duì)表達(dá)量隨暴露時(shí)間的增加而降低，其余各蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，具有時(shí)間依賴關(guān)系。 7.加入caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理后，與不加組相比，，細(xì)胞凋亡率明顯減少，Caspase-3和Caspase-9的蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1. MC-LR能導(dǎo)致16HBE細(xì)胞發(fā)生凋亡。 2. MC-LR誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制是線粒體Caspase依賴性途徑。
【關(guān)鍵詞】：微囊藻毒素-LR 人支氣管上皮細(xì)胞 凋亡機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R562
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目錄9-11
• 圖表清單11-12
• 縮略詞表12-13
• 1 前言13-16
• 2 材料與方法16-26
• 2.1 細(xì)胞株16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑16-17
• 2.3 主要試劑配制17-19
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法19-25
• 2.4.1 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞活性的測(cè)定19-20
• 2.4.2 16HBE 細(xì)胞中 ROS 的測(cè)定20-21
• 2.4.3 16HBE 細(xì)胞中線粒體膜電位（MMP）的測(cè)定21
• 2.4.4 Caspase 抑制劑 Z-VAD-FMK 對(duì)細(xì)胞活性的影響21-22
• 2.4.5 加入 Z-VAD-FMK 預(yù)處理，MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞活性的影響22
• 2.4.6 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定22
• 2.4.7 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞線粒體途徑相關(guān)分子的測(cè)定22-25
• 2.5 統(tǒng)計(jì)分析方法25-26
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-39
• 3.1 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞活性的影響26-27
• 3.2 不同濃度的 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞內(nèi) ROS 的影響27-28
• 3.3 不同濃度的 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞線粒體膜電位的影響28-29
• 3.4 Caspase 抑制劑 Z-VAD-FMK 對(duì)細(xì)胞活性的影響29-30
• 3.5 加入 Z-VAD-FMK 預(yù)處理后 MC-LR 對(duì)細(xì)胞活性的影響30-31
• 3.6 不同濃度 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞凋亡率的影響31-33
• 3.7 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響33-35
• 3.8 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞中線粒體途徑中相關(guān)分子表達(dá)的影響35-39
• 4 討論39-43
• 4.1 細(xì)胞模型的建立39
• 4.2 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞活性及凋亡的影響39-40
• 4.3 ROS 參與 MC-LR 誘導(dǎo) 16HBE 細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)40-41
• 4.4 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的影響41
• 4.5 MC-LR 對(duì) 16HBE 細(xì)胞中線粒體途徑相關(guān)蛋白的影響41-43
• 5 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 綜述48-63
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷63-64
• 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：272896