【摘要】： 研究背景和目的: 嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎(eosinophilic bronchitis,EB)是慢性咳嗽的主要原因。誘導(dǎo)痰和氣道粘膜病理檢查表明,EB同樣存在以嗜酸性粒細(xì)胞為主的多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。但EB為何缺乏氣道高反應(yīng)性,EB是否會(huì)發(fā)展為氣道高反應(yīng)性或支氣管哮喘(bronchial asthma)?本研究通過(guò)觀察EB的臨床特征及免疫病理特征,分析其與支氣管哮喘患者的差異。同時(shí),通過(guò)研究EB和哮喘支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)細(xì)胞蛋白質(zhì)組雙向電泳表達(dá)譜,找出表達(dá)差異蛋白,為篩選氣道高反應(yīng)性和氣流可逆性阻塞相關(guān)的特異蛋白、探討哮喘氣道高反應(yīng)性和氣流可逆性的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上,探討建立缺乏氣道高反應(yīng)性的EB動(dòng)物模型的可能性和途徑,試圖從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入研究EB和哮喘的關(guān)系,為支氣管哮喘的早期干預(yù)尋找新的靶點(diǎn)。 結(jié)果及結(jié)論: 1. EB和哮喘的氣道炎癥病理特點(diǎn)相似,涉及多種炎癥細(xì)胞,包括嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil,Eos)、T淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞等,但EB的氣道炎癥程度較哮喘輕,炎癥范圍更為局限。 2.雙向電泳圖像對(duì)比分析表明,EB與哮喘之間BLAF細(xì)胞蛋白表達(dá)存在一定的差異。本研究成功鑒定了EB、哮喘之間的2個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶T1(glutathione-S-transferase T1,GSTT1)可能與氣道反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。 3.初步成功建立了具有明顯的Eos氣道炎癥、但無(wú)氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠EB模型,為進(jìn)一步了解EB的氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 第一部分:嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎與支氣管哮喘患者免疫病理特征的比較 目的: 了解EB氣道的病理學(xué)特征,比較其與支氣管哮喘氣道炎癥的異同。 方法: 對(duì)20例EB、24例支氣管哮喘和10例正常人進(jìn)行誘導(dǎo)痰檢查,分析誘導(dǎo)痰的細(xì)胞分類;經(jīng)支氣管纖維鏡支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage,BAL),分析BALF的細(xì)胞分類;于隆突、左舌葉開(kāi)口、右下葉前段取支氣管粘膜活檢,光鏡下觀察活檢標(biāo)本的病理結(jié)構(gòu)特征,測(cè)量氣道上皮粘膜的基底膜厚度,通過(guò)免疫組化技術(shù),觀察氣道粘膜上皮層和上皮下層炎癥細(xì)胞(Eos、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞)的分布情況并計(jì)算其細(xì)胞分布密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的計(jì)量資料用中位數(shù)表示,組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。 結(jié)果: 1. EB組痰Eos百分率[10.13%(20.19)]顯著低于哮喘組[26.00%(32.97)](P0.05)。EB組和哮喘組誘導(dǎo)痰Eos百分率均顯著高于對(duì)照組[0.25%(0.50)](P0.001)。 2. EB組BALF的Eos百分率[1.63%(3.81)]顯著低于哮喘組[11.75%(15.70)](P0.001),EB組和哮喘組BALF的Eos百分率均顯著高于對(duì)照組[0.38%(1.00)(P0.05)。 3.哮喘組舌葉開(kāi)口支氣管粘膜基底膜厚度[4.73μm(2.61)]顯著大于正常對(duì)照組[3.23μm(1.35)](P0.001)和EB組[3.41μm(1.89)](P0.01),但EB組和正常對(duì)照組之間無(wú)差異(P0.05)。哮喘組右下葉前段支氣管粘膜基底膜厚度[5.36μm(3.65)]顯著大于EB組[3.53μm(3.18)](P0.05)。) 4.比較舌葉支氣管粘膜上皮下層的Eos分布密度,哮喘組[8.91個(gè)/mm2 (52.88)]顯著高于EB組[0.00個(gè)/mm2 (10.40)]和正常對(duì)照組[0.00個(gè)/mm2 (0.00)](P0.05)。 5.比較舌葉支氣管粘膜上皮層的淋巴細(xì)胞分布密度,EB組[475.76個(gè)/mm2(244.75)]和哮喘組[583.29個(gè)/mm2(507.69)]顯著高于正常對(duì)照組[260.71個(gè)/mm2(430.31)] ,而EB和哮喘組差異無(wú)顯著性(P0.05)。 6.比較舌葉支氣管粘膜的肥大細(xì)胞分布密度:在粘膜上皮層,EB組[168.80個(gè)/mm(2314.28)]和哮喘組[252.78個(gè)/mm(2545.68)]顯著高于正常對(duì)照組[0.00個(gè)/mm2(13.61)];在粘膜上皮下層,EB組[218.44個(gè)/mm2(383.65)]和哮喘組[197.22個(gè)/mm2(208.54)]顯著高于正常對(duì)照組[66.07個(gè)/mm2(45.92)];而EB和哮喘組差異無(wú)顯著性(P0.05)。 結(jié)論: EB和哮喘的氣道炎癥病理特點(diǎn)相似,涉及嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞,但EB的氣道炎癥程度較哮喘輕,炎癥范圍更為局限。 第二部分:嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎與支氣管哮喘分子生物基礎(chǔ)差異的初步探討 研究背景和目的: 在前面的研究中,我們發(fā)現(xiàn)EB和哮喘氣道炎癥病理盡管有很多相似的地方,但也有明顯的差異。支氣管肺泡灌洗液能夠比較直接和客觀地反映氣道炎癥的變化,被認(rèn)為是蛋白組學(xué)研究氣道炎癥性疾病的理想樣本。本實(shí)驗(yàn)的目的是利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法,探討EB與支氣管哮喘差異的分子生物學(xué)基礎(chǔ),以篩選鑒定與氣道高反應(yīng)性、氣流可逆性阻塞相關(guān)的特異蛋白。 方法: 收集EB 5例、哮喘和正常人各6例,經(jīng)纖維支氣管鏡于右中葉行支氣管肺泡灌洗取得BALF,提取BALF細(xì)胞總蛋白質(zhì)后,利用固相pH梯度(immobilized pH gradient, IPG),雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)對(duì)總蛋白進(jìn)行分離,然后行硝酸銀染色,予ImageMaster 2D Elite 5.0分析軟件進(jìn)行凝膠圖像分析,尋找EB、哮喘和正常對(duì)照組差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。應(yīng)用基質(zhì)輔助電離解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assitsted laser desorption / ionization time of -flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprint, PMF),再通過(guò)MALDI-TOF/TOF-MS串級(jí)質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行序列分析,得到蛋白質(zhì)二級(jí)質(zhì)譜圖。最后利用Mascot軟件搜索NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),將獲得的肽段信息進(jìn)行對(duì)比分析,明確是何種蛋白質(zhì)。 結(jié)果: 雙向電泳圖像對(duì)比分析表明,EB、哮喘和正常對(duì)照組BLAF細(xì)胞蛋白表達(dá)有一定的差異。各蛋白斑點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)肽質(zhì)量指紋譜與標(biāo)準(zhǔn)分子量、等電點(diǎn)對(duì)照分析鑒定出2個(gè)蛋白,分別為鐵蛋白(ferritin, light polypeptide)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶T1(glutathione-S-transferase T1,GSTT1),其中鐵蛋白在哮喘組表達(dá)上調(diào)。EB組中GSTT1高表達(dá),而83.3%哮喘患者和33.3正常對(duì)照不表達(dá)GSTT1。 結(jié)論: 1.電泳圖像對(duì)比分析表明,EB與哮喘之間BLAF細(xì)胞蛋白表達(dá)存在一定的差異。 2.成功鑒定了EB和哮喘之間的2個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中GSTT1可能與氣道反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。 第三部分嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎動(dòng)物模型的建立及其與哮喘動(dòng)物模型的氣道炎癥的比較 分題1小鼠氣道反應(yīng)性方法的建立 目的: 建立過(guò)敏性小鼠氣道反應(yīng)性檢查的正確方法。 方法: 采用SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠,通過(guò)OVA致敏和激發(fā)的方法建立過(guò)敏性氣道炎癥模型(下稱OVA組,n=36),第0、7、14d分別給予10μg OVA+1.3mg Al(OH)3生理鹽水混懸液200μl腹腔注射致敏,第28d予100ug OVA滴鼻激發(fā)。生理鹽水作為正常對(duì)照(下稱NS組,n=36)。根據(jù)肺功能檢查方法的不同再細(xì)分為4組:無(wú)創(chuàng)OVA組,無(wú)創(chuàng)NS組,有創(chuàng)OVA組,有創(chuàng)NS組,每組18只。氣道反應(yīng)性檢查采用Buxco公司有創(chuàng)肺功能檢查系統(tǒng)(“RC”系統(tǒng))及無(wú)創(chuàng)肺功能檢查系統(tǒng)(“Penh”系統(tǒng))。激發(fā)24小時(shí)(第29天)后,以吸入倍增濃度的乙酰甲膽堿(methacholine ,Mch)霧化液[濃度依次為0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50(mg/ml)檢查小鼠的氣道反應(yīng)性。有創(chuàng)檢查時(shí),以肺阻力(lung resistance,RL)為觀察指標(biāo),通過(guò)藥物的劑量-反應(yīng)曲線來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物的氣道反應(yīng)性。無(wú)創(chuàng)檢查時(shí),以Penh為觀察指標(biāo),通過(guò)藥物的劑量-反應(yīng)曲線及Penh較基礎(chǔ)值上升100%、200%的吸入Mch的濃度(Penh200、Penh300)來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物的氣道反應(yīng)性。檢查BALF細(xì)胞學(xué)分類和上氣道、肺組織病理改變。另予0.3mM,3.0mM和30mM組織胺對(duì)OVA和NS組進(jìn)行鼻組胺激發(fā)試驗(yàn),每次激發(fā)后,觀察10分鐘內(nèi)小鼠的打噴嚏和擦鼻次數(shù),通過(guò)藥物的劑量-反應(yīng)曲線比較兩組的差異。 結(jié)果: 1.OVA組及NS組Penh%,RL%均有隨Mch濃度升高而增加的趨勢(shì),吸入濃度為6.25、12.5、25mg/ml的Mch時(shí),無(wú)創(chuàng)OVA組Penh%顯著高于無(wú)創(chuàng)NS組(P0.05 ),且Penh200、Penh300顯著低于無(wú)創(chuàng)NS組(P0.001)。而有創(chuàng)OVA組氣道反應(yīng)性與有創(chuàng)NS組無(wú)顯著差異(P0.05 )。 2.OVA組BALF中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞百分率顯著高于NS組(P0.01)。與NS組比較,OVA組肺組織炎癥改變明顯(P0.01)。而無(wú)創(chuàng)OVA組BALF的Eos百分比[(27.06±12.05)%]和細(xì)胞總數(shù)[(2.69±0.55)×105/ml)]與有創(chuàng)OVA組[(25.33±10.79)%,(2.86±0.55)×105/ml)]無(wú)顯著差異,兩組下呼吸道組織病理評(píng)分亦無(wú)顯著差異(P0.05 )。 3.鼻組胺激發(fā)試驗(yàn)顯示,在30mM組織胺濃度時(shí),OVA組擦鼻次數(shù)[(73.00±28.30)次]顯著高于對(duì)照組[(43.40±34.07)次](P0.05 )。OVA組上呼吸道病理檢查顯示上呼吸道輕度Eos炎癥改變。 結(jié)論: 1.無(wú)創(chuàng)檢查法較有創(chuàng)檢查法對(duì)同一氣道過(guò)敏疾病模型氣道反應(yīng)性的結(jié)果不相一致,其原因可能是模型氣道炎癥程度較輕,無(wú)創(chuàng)檢查法受到上呼吸道阻力增加的影響所致。 2.首次檢查小鼠過(guò)敏性氣道炎癥模型氣道反應(yīng)性時(shí),建議先用有創(chuàng)檢查方法進(jìn)行確定。 分題2嗜酸粒細(xì)胞性氣道炎癥的小鼠模型的建立 目的: 通過(guò)調(diào)節(jié)抗原激發(fā)的時(shí)間、途徑和劑量,建立無(wú)氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠EB模型。 方法: 56只BALB/c雌性小鼠,分為4組:氣道過(guò)敏霧化組(下稱OVA-霧化組,n=8)、氣道過(guò)敏1次滴鼻組(下稱OVA 1次滴鼻組,n=12)、氣道過(guò)敏2次滴鼻組(下稱OVA 2次滴鼻組,n=8)、生理鹽水對(duì)照組(下稱對(duì)照組, n=28)。致敏方法同前。OVA-霧化組第28d予1%OVA霧化30分鐘激發(fā);OVA-1次滴鼻組第28天予100ug OVA滴鼻激發(fā);OVA-2次滴鼻組第28d,第29天各予100ug OVA滴鼻激發(fā)。對(duì)照組因各模型組致敏、激發(fā)時(shí)間采用生理鹽水進(jìn)行致敏和激發(fā)。最后一次激發(fā)24小時(shí)后,有創(chuàng)檢查法測(cè)定動(dòng)物的氣道反應(yīng)性,并觀察氣道炎癥情況。 結(jié)果: 1.氣道反應(yīng)性的測(cè)定:激發(fā)24小時(shí)后,各組RL%均有隨Mch濃度升高而增加的趨勢(shì)。在吸入濃度為0.39-50mg/ml的Mch時(shí),OVA 1次滴鼻組和OVA霧化組RL%較對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P 0.05);在吸入濃度為25mg/ml的Mch時(shí),OVA 2次滴鼻組RL%顯著高于對(duì)照組(P 0.05)。 2.各模型組巨噬細(xì)胞百分率顯著低于對(duì)照組(P0.05),而中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞百分率和淋巴細(xì)胞百分率顯著高于對(duì)照組(P0.05)。 3. OVA霧化組巨噬細(xì)胞百分率顯著高于OVA1次滴鼻組和OVA 2次滴鼻組(P0.01,P0.001),而嗜酸性粒細(xì)胞百分率[(7.40±3.41)%]顯著低于OVA 1次滴鼻組[(25.33±10.79)%]和OVA 2次滴鼻組[(39.73±6.02)%](P0.01,P0.001)。 結(jié)論: 通過(guò)調(diào)節(jié)抗原激發(fā)的時(shí)間、途徑和劑量,本實(shí)驗(yàn)初步成功建立了具有明顯的Eos氣道炎癥、但無(wú)氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠EB模型,為進(jìn)一步研究EB的氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 分題3嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎動(dòng)物模型的氣道炎癥及其與哮喘動(dòng)物模型的比較 目的: 觀察BALB/c小鼠EB模型的氣道炎癥特征并比較其與哮喘動(dòng)物模型的氣道炎癥的差異。 方法: 80只BALB/c雌性小鼠,分為3組:EB模型組(下稱EB組,n=28)、哮喘模型組(下稱哮喘組,n=12)、生理鹽水對(duì)照組(下稱對(duì)照組,n=40)。致敏方法同前。EB模型組第28d予100ug OVA滴鼻激發(fā);哮喘組第28,29,30d予100ug OVA滴鼻激發(fā)(每天1次)。對(duì)照組因每組致敏、激發(fā)時(shí)間采用生理鹽水進(jìn)行致敏和激發(fā)。在末次激發(fā)24小時(shí)后,各組(n=12)分別檢測(cè)小鼠的下列指標(biāo):有創(chuàng)檢查法測(cè)定氣道高反應(yīng)性,支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類,支氣管及肺組織炎癥程度。此外,在末次激發(fā)12、48小時(shí)后,分別觀察EB組和對(duì)照組氣道高反應(yīng)性、BALF細(xì)胞分類的變化情況(每組n=8)。 結(jié)果: 1.氣道反應(yīng)性的測(cè)定:激發(fā)12小時(shí)、24小時(shí)及48小時(shí)后,EB組氣道反應(yīng)性與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P0.05 )。而哮喘組在末次激發(fā)24小時(shí)后,在吸入濃度為12.5、25、50mg/ml的Mch時(shí),RL%均顯著高于對(duì)照組(P0.05)。 2.氣道炎癥:EB組滴鼻激發(fā)12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后BALF的Eos百分比呈逐漸增加的趨勢(shì)(P0.05)。激發(fā)24小時(shí)后,EB、哮喘模型組BALF巨噬細(xì)胞百分率顯著低于對(duì)照組(P0.05),而中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞百分率和淋巴細(xì)胞百分率顯著高于對(duì)照組(P0.05)。哮喘組BALF的Eos百分比[(42.15±13.35)%]和細(xì)胞總數(shù)[(7.59±1.33)×105/ml)]明顯高于EB組[(25.33±10.79)%,(2.86±0.55)×105/ml)] (P0.05),而中性粒細(xì)胞百分比[(11.14±6.61)%]顯著低于EB組[(23.89±23.67)%](P0.05)。激發(fā)24小時(shí)后,哮喘組支氣管肺部炎癥組織病理評(píng)分顯著高于EB組(P0.05)。 結(jié)論: 1.隨著激發(fā)后時(shí)間的增加,EB模型的Eos氣道炎癥有逐步加重趨勢(shì),但并未觀察到氣道反應(yīng)性的變化。 2.本研究建立的EB模型的氣道炎癥程度輕于哮喘模型組。
【圖文】：

對(duì)照誘導(dǎo)痰細(xì)胞涂片HE×400

EB誘導(dǎo)痰細(xì)胞涂片HE×400
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R562.25

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 陳莉延;嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎小鼠模型的建立及其蛋白組學(xué)研究[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2010年

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本文編號(hào)：2699325