發(fā)布時(shí)間：2017-03-26 10:15

  本文關(guān)鍵詞：ATF3通過(guò)AP-1調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道粘液高分泌，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：眾所周知,粘液的過(guò)表達(dá)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的重要病理特征。研究表明,香煙煙霧(cigarette smoke,CS)暴露與COPD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。氣道粘液的過(guò)度分泌可引起氣道阻塞,從而導(dǎo)致肺功能下降。轉(zhuǎn)錄激活因子3(Activating transcription factor3, ATF3)是一種參與細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程的適應(yīng)性反應(yīng)基因。研究顯示其對(duì)炎癥反應(yīng)具有雙向調(diào)節(jié)作用,通過(guò)調(diào)節(jié)不同的靶基因從而加強(qiáng)或抑制炎癥反應(yīng),機(jī)體會(huì)根據(jù)應(yīng)激條件的性質(zhì)(如應(yīng)激的類型和持續(xù)的時(shí)間)和應(yīng)激信號(hào)影響靶組織/細(xì)胞類型的不同而發(fā)生不同的反應(yīng)。據(jù)報(bào)道,氣道粘液的過(guò)表達(dá)也是氣道炎癥反應(yīng)的一種表現(xiàn)形式。然而,迄今為止國(guó)內(nèi)外尚未有研究探討氣道上皮細(xì)胞中ATF3的表達(dá)在調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道粘液分泌中的作用。 目的：本課題擬探討ATF3是否參與調(diào)控COPD中MUC5AC(氣道粘液的一種重要組成成分)的表達(dá),并探索其機(jī)制。 方法：檢測(cè)香煙煙霧暴露對(duì)人體氣道上皮細(xì)胞HBE(正常氣道上皮細(xì)胞系),NCI-H292細(xì)胞(人肺粘液表皮樣癌來(lái)源細(xì)胞系)和MTEC(小鼠原代氣道上皮細(xì)胞)的ATF3和MUC5AC的表達(dá)影響。利用ATF3小干擾RNA(ATF3small-interfering RNA, ATF3siRNA)和ATF3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒探討ATF3是否與香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC的表達(dá)有關(guān)。利用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, Q-PCR),蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot, WB)和免疫熒光(immunofluorescence, IF)檢測(cè)ATF3的缺失或過(guò)表達(dá)是否影響香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC的表達(dá)。進(jìn)一步利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)及染色體免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, CHIP)法驗(yàn)證假設(shè),即ATF3是否通過(guò)激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)間接結(jié)合到MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域從而調(diào)控其表達(dá)。在體內(nèi)研究中,我們用通過(guò)CSE氣道滴注和熏煙制造ATF3基因敲除小鼠(ATF3-/-mice)的COPD模型,從而驗(yàn)證ATF3是否參與調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道粘液的表達(dá)。 結(jié)果： 1.體外實(shí)驗(yàn)中,香煙煙霧能顯著地誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞HBE, NCI-H292和MTEC中ATF3和MUC5AC的表達(dá)。當(dāng)用ATF3siRNA特異性地敲除ATF3這個(gè)基因后,香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC的表達(dá)顯著下降,而白介素-6(interleukin-6, IL-6)和白介素-8(interleukin-8, IL-8)的表達(dá)明顯增高。然而,ATF3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒未對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC的表達(dá)產(chǎn)生明顯影響。這一現(xiàn)象提示,ATF3可能并非直接調(diào)控MUC5AC的表達(dá)。Co-IP和CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ATF3通過(guò)AP-1信號(hào)通路作用于MUC5AC的啟動(dòng)子區(qū)域,從而間接調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道MUC5AC的表達(dá)。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,CSE氣道滴注野生型小鼠(Wild Type mice, WT mice)大氣道MUC5AC的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高,然而在ATF3-/-小鼠中氣道MUC5AC的表達(dá)并未明顯下降。這和體內(nèi)的結(jié)果并不一致。然而,在ATF3-/-小鼠模型組中,氣管及血管周圍中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯增加。(體內(nèi)模型需進(jìn)一步參照熏煙小鼠的結(jié)果)。 結(jié)論：本研究結(jié)果提示ATF3通過(guò)AP-1促進(jìn)香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道MUC5AC的表達(dá),同時(shí)ATF3能抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的IL-6, IL-8的表達(dá)。ATF3在調(diào)節(jié)COPD氣道粘液高分泌和炎癥反應(yīng)中具有重要作用,研究結(jié)果為臨床的靶向治療提供重要參考。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)錄激活因子-3 MUC5AC 香煙煙霧 激活蛋白-1 白介素-6 白介素-8
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R563.9
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略語(yǔ)中英文對(duì)照11-12
• 目次12-14
• 第一章 引言14-16
• 第二章 材料與方法16-43
• 2.1 香煙煙霧提取物16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• 2.3 使用的主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備16-17
• 2.4 實(shí)驗(yàn)試劑與材料17-23
• 2.4.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料17-19
• 2.4.2 實(shí)驗(yàn)試劑配制19-23
• 2.5 實(shí)驗(yàn)方法23-43
• 2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)23
• 2.5.2 siRNA轉(zhuǎn)染23-24
• 2.5.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24-25
• 2.5.4 細(xì)胞總mRNA的提取及組織總mRNA的提取25-27
• 2.5.5 cDNA的合成及Q-PCR過(guò)程27-29
• 2.5.6 Western Blot29-31
• 2.5.7 免疫熒光31-33
• 2.5.8 免疫共沉淀(IP)33-34
• 2.5.9 染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)34-39
• 2.5.10 小鼠原代氣道上皮細(xì)胞(MTEC)培養(yǎng)39-41
• 2.5.11 構(gòu)建小鼠CSE氣道滴注模型41
• 2.5.12 構(gòu)建小鼠熏煙3月模型41-42
• 2.5.13 動(dòng)物處理及標(biāo)本收集42
• 2.5.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析42-43
• 第三章 研究結(jié)果43-58
• 3.1 香煙煙霧能誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞MUC5AC的分泌43-44
• 3.2 香煙煙霧能誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞ATF3的表達(dá)44-46
• 3.3 特異性敲除ATF3能下調(diào)香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC的表達(dá)46-48
• 3.4 ATF3過(guò)表達(dá)對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC高表達(dá)無(wú)影響48-50
• 3.5 特異性敲除ATF3能上調(diào)香煙煙霧誘導(dǎo)的IL-6,IL-8的表達(dá)50
• 3.6 香煙煙霧能激活A(yù)TF3-AP-1信號(hào)通路50-54
• 3.7 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,ATF3的缺失并不能緩解香煙煙霧引起的氣道MUC5AC的分泌54-58
• 第四章 討論58-60
• 第五章 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 綜述64-75
• 參考文獻(xiàn)70-75
• 作者簡(jiǎn)歷及在讀期間所取得的科研成果75

【共引文獻(xiàn)】

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