【摘要】：第一部分超表達STAT4和STAT6穩(wěn)定Jurkat細胞系的建立 目的:構建STAT4及STAT6超表達Jurkat穩(wěn)定轉染細胞系,以便向該細胞系中轉染干擾質粒導致STAT4、STAT6和CBP基因沉默,觀察轉錄因子STAT4、STAT6及CBP在Jurkat細胞中的相互效應。 方法:使用DMRIE-C分別將質粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-STAT4和pIRES2-EGFP-STAT6轉染入Jurkat細胞,并利用質粒編碼蛋白中的Neo/Kan酶活性,使用G418篩選出穩(wěn)定表達STAT4及STAT6的穩(wěn)定細胞系。 結果:①質粒與DMRIE-C最佳比例隨細胞接種密度改變而發(fā)生變化。②當接種Jurkat細胞為2.5×105/cm~2時,G418 500 mg/ml為合理的穩(wěn)定篩選濃度。③在G418篩選下,轉染質粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-STAT4和pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat細胞,其GFP表達高峰分別在轉染后第3~4天、第6~7天和第9天出現。④使用脂質體DMRIE-C轉染Jurkat細胞,2.5×105/cm~2組與1.5×10~5/cm~2組轉染率相差不大。⑤經G418篩選,1.5×105/cm~2組篩出穩(wěn)定轉染的細胞克隆,但是2.5×10~5/cm~2組未篩出。⑥轉染質粒pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat細胞經G418篩選,出現穩(wěn)定轉染的細胞克隆,轉染質粒pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat細胞則未篩選出任何克隆。 結論:經過DMRIE-C轉染和G418篩選,發(fā)現了質粒表達的一些特點,獲得了穩(wěn)定篩選的一些經驗,轉染pIRES2-EGFP-STAT6質粒的Jurkat細胞出現了穩(wěn)定表達的細胞克隆,但轉染STAT4質粒的Jurkat細胞因轉染率過低未能篩選出穩(wěn)定細胞系。 第二部分Lipofectamine? LTX轉染Jurkat細胞條件的優(yōu)化 目的:優(yōu)化陽離子脂質體Lipofectamine? LTX轉染懸浮細胞Jurkat的條件,以建立更為有效的轉染方案。 方法:把帶有綠色熒光蛋白(GFP)基因的兩種質粒pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-STAT6作為基因載體,采用Lipofectamine? LTX轉染Jurkat細胞,檢測細胞轉染狀態(tài)、脂質體與DNA的比例、細胞接種密度、不同量培養(yǎng)基等對轉染效果的影響,比較瞬時轉染效果。 結果:Jurkat細胞生長速度與細胞密度密切相關,轉染前1 d換液,可保證細胞的良好生長狀態(tài),培養(yǎng)基新鮮度對細胞狀態(tài)影響不大。Lipofectamine? LTX體積與質粒質量之比為2.75μl:500 ng時,其轉染效果明顯優(yōu)于其他各組;適當加大轉染時Jurkat細胞的鋪板密度,可以明顯提高轉染試劑的利用率;轉染48 h后,300μl/孔組的熒光陽性率是600μl/孔組的(1.4±0.2)倍,差異有統計學意義(P0.05);轉染后24 h,各比例組(按照Lipofectamine(?) LTX體積與質粒質量分組)轉染效果差異無統計學意義(P0.05);轉染48 h后,各比例組轉染效果差異顯著(P 0.05),且Lipofectamine(?) LTX轉染兩種質粒效果差異有統計學意義(P0.05)。 結論:對Lipofectamine(?) LTX轉染懸浮細胞Jurkat做出了一些建設性意見,并闡述了轉染后基因的一些表達規(guī)律,以期對懸浮細胞的轉染提供相關參考。 第三部分STAT4、STAT6及CBP相應基因沉默在Jurkat細胞中的相互影響觀察 目的:利用基因沉默技術,觀察由此引起的效應,并分析轉錄因子STAT4、STAT6及CBP在基因轉錄之間的相互關系。 方法:使用陽離子脂質體Lipofectamine(?) LTX分別將質粒pGenesil-3-shSTAT4、pGenesil-3-shSTAT6或pGenesil-3-shCBP與檢測質粒pGL3-IL-4R和pCAT3-IFN-γ共轉染入Jurkat細胞,用IL-12和IL-4激活Jak-STATs信號通路,利用熒光素酶報告基因檢測試劑和氯霉素乙酰轉移酶ELISA試劑盒檢測,觀察靶基因的活性。 結果:基因CBP的沉默可以導致基因IL4R和IFNG啟動子活性的下降,統計學分析有意義(P0.05);基因STAT4和STAT6的沉默所得結果沒有統計學意義(P0.05)。 結論:①CBP是啟動基因IL4R和IFNG轉錄的重要輔助分子;②CBP在Jurkat細胞中的表達是有限的;③在人和小鼠細胞中的CBP結構可能高度保守。④轉錄因子STAT4和STAT6之間的相互關系暫時無法確定。
【圖文】：

向效應亞群 Th1 和 Th2 分化過程中，受調節(jié)性轉錄因子 STATs 的嚴，STAT6 和 STAT4 分別對 Th2 和 Th1 細胞的增殖和分化具有關鍵性作效應性和記憶性 Th2 細胞的存活都是必需的[3]。STAT6 基因敲除的 Th2 細胞，且有嚴重的 IgE 分泌缺陷[11]�；罨銐虻� STAT6 不但能h2 分化，甚至還會逆轉 Th0 細胞向 Th1 分化的趨勢[3]。在 STAT4 基內，Th0 細胞缺失了向 Th1 細胞分化的能力，反而顯示出向 Th2 細[23]。見表 1-1。由于STAT4和STAT6對Th1和 Th2細胞分化具有的這種舉足輕重的時，考慮到 Jurkat 轉染率較低，直接將干擾質粒轉染入 Jurkat 細胞可理想的統計學數據，因此迫切需要構建 STAT4 和 STAT6 的穩(wěn)定超表穩(wěn)定超表達的基礎上進行基因沉默，以利于進一步研究。

于 Jurkat 細胞難以轉染，，本實驗選用了專門用于懸浮細胞、可進行穩(wěn)定離子脂質體轉染試劑——DMRIE-C[25 27]。離子脂質體轉染機理[28]：陽離子脂質體與質粒相遇后迅速通過靜電作用脂質體結構發(fā)生轉變, 最終完全包裹住質粒, 形成脂質體-質粒復合體。脂復合體進入細胞的途徑目前認為有 3 種模式：與細胞質膜融合方式、細直接滲透。其中，胞吞作用被認為是復合體進入細胞的主要機制。進入質粒從復合物分離出來，啟動基因轉錄并發(fā)揮轉染效力。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R562.25

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