【摘要】：第一部分超表達(dá)STAT4和STAT6穩(wěn)定Jurkat細(xì)胞系的建立 目的:構(gòu)建STAT4及STAT6超表達(dá)Jurkat穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,以便向該細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒導(dǎo)致STAT4、STAT6和CBP基因沉默,觀察轉(zhuǎn)錄因子STAT4、STAT6及CBP在Jurkat細(xì)胞中的相互效應(yīng)。 方法:使用DMRIE-C分別將質(zhì)粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-STAT4和pIRES2-EGFP-STAT6轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞,并利用質(zhì)粒編碼蛋白中的Neo/Kan酶活性,使用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)STAT4及STAT6的穩(wěn)定細(xì)胞系。 結(jié)果:①質(zhì)粒與DMRIE-C最佳比例隨細(xì)胞接種密度改變而發(fā)生變化。②當(dāng)接種Jurkat細(xì)胞為2.5×105/cm~2時,G418 500 mg/ml為合理的穩(wěn)定篩選濃度。③在G418篩選下,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-STAT4和pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat細(xì)胞,其GFP表達(dá)高峰分別在轉(zhuǎn)染后第3~4天、第6~7天和第9天出現(xiàn)。④使用脂質(zhì)體DMRIE-C轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞,2.5×105/cm~2組與1.5×10~5/cm~2組轉(zhuǎn)染率相差不大。⑤經(jīng)G418篩選,1.5×105/cm~2組篩出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆,但是2.5×10~5/cm~2組未篩出。⑥轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat細(xì)胞經(jīng)G418篩選,出現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat細(xì)胞則未篩選出任何克隆。 結(jié)論:經(jīng)過DMRIE-C轉(zhuǎn)染和G418篩選,發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒表達(dá)的一些特點(diǎn),獲得了穩(wěn)定篩選的一些經(jīng)驗(yàn),轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-STAT6質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞出現(xiàn)了穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆,但轉(zhuǎn)染STAT4質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞因轉(zhuǎn)染率過低未能篩選出穩(wěn)定細(xì)胞系。 第二部分Lipofectamine? LTX轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞條件的優(yōu)化 目的:優(yōu)化陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine? LTX轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞Jurkat的條件,以建立更為有效的轉(zhuǎn)染方案。 方法:把帶有綠色熒光蛋白(GFP)基因的兩種質(zhì)粒pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-STAT6作為基因載體,采用Lipofectamine? LTX轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞,檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染狀態(tài)、脂質(zhì)體與DNA的比例、細(xì)胞接種密度、不同量培養(yǎng)基等對轉(zhuǎn)染效果的影響,比較瞬時轉(zhuǎn)染效果。 結(jié)果:Jurkat細(xì)胞生長速度與細(xì)胞密度密切相關(guān),轉(zhuǎn)染前1 d換液,可保證細(xì)胞的良好生長狀態(tài),培養(yǎng)基新鮮度對細(xì)胞狀態(tài)影響不大。Lipofectamine? LTX體積與質(zhì)粒質(zhì)量之比為2.75μl:500 ng時,其轉(zhuǎn)染效果明顯優(yōu)于其他各組;適當(dāng)加大轉(zhuǎn)染時Jurkat細(xì)胞的鋪板密度,可以明顯提高轉(zhuǎn)染試劑的利用率;轉(zhuǎn)染48 h后,300μl/孔組的熒光陽性率是600μl/孔組的(1.4±0.2)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);轉(zhuǎn)染后24 h,各比例組(按照Lipofectamine(?) LTX體積與質(zhì)粒質(zhì)量分組)轉(zhuǎn)染效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);轉(zhuǎn)染48 h后,各比例組轉(zhuǎn)染效果差異顯著(P 0.05),且Lipofectamine(?) LTX轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:對Lipofectamine(?) LTX轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞Jurkat做出了一些建設(shè)性意見,并闡述了轉(zhuǎn)染后基因的一些表達(dá)規(guī)律,以期對懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染提供相關(guān)參考。 第三部分STAT4、STAT6及CBP相應(yīng)基因沉默在Jurkat細(xì)胞中的相互影響觀察 目的:利用基因沉默技術(shù),觀察由此引起的效應(yīng),并分析轉(zhuǎn)錄因子STAT4、STAT6及CBP在基因轉(zhuǎn)錄之間的相互關(guān)系。 方法:使用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine(?) LTX分別將質(zhì)粒pGenesil-3-shSTAT4、pGenesil-3-shSTAT6或pGenesil-3-shCBP與檢測質(zhì)粒pGL3-IL-4R和pCAT3-IFN-γ共轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞,用IL-12和IL-4激活Jak-STATs信號通路,利用熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶ELISA試劑盒檢測,觀察靶基因的活性。 結(jié)果:基因CBP的沉默可以導(dǎo)致基因IL4R和IFNG啟動子活性的下降,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義(P0.05);基因STAT4和STAT6的沉默所得結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:①CBP是啟動基因IL4R和IFNG轉(zhuǎn)錄的重要輔助分子;②CBP在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)是有限的;③在人和小鼠細(xì)胞中的CBP結(jié)構(gòu)可能高度保守。④轉(zhuǎn)錄因子STAT4和STAT6之間的相互關(guān)系暫時無法確定。
【圖文】：

向效應(yīng)亞群 Th1 和 Th2 分化過程中，受調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄因子 STATs 的嚴(yán)，STAT6 和 STAT4 分別對 Th2 和 Th1 細(xì)胞的增殖和分化具有關(guān)鍵性作效應(yīng)性和記憶性 Th2 細(xì)胞的存活都是必需的[3]。STAT6 基因敲除的 Th2 細(xì)胞，且有嚴(yán)重的 IgE 分泌缺陷[11]。活化足夠的 STAT6 不但能h2 分化，甚至還會逆轉(zhuǎn) Th0 細(xì)胞向 Th1 分化的趨勢[3]。在 STAT4 基內(nèi)，Th0 細(xì)胞缺失了向 Th1 細(xì)胞分化的能力，反而顯示出向 Th2 細(xì)[23]。見表 1-1。由于STAT4和STAT6對Th1和 Th2細(xì)胞分化具有的這種舉足輕重的時，考慮到 Jurkat 轉(zhuǎn)染率較低，直接將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入 Jurkat 細(xì)胞可理想的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，因此迫切需要構(gòu)建 STAT4 和 STAT6 的穩(wěn)定超表穩(wěn)定超表達(dá)的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因沉默，以利于進(jìn)一步研究。

于 Jurkat 細(xì)胞難以轉(zhuǎn)染，，本實(shí)驗(yàn)選用了專門用于懸浮細(xì)胞、可進(jìn)行穩(wěn)定離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑——DMRIE-C[25 27]。離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染機(jī)理[28]：陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒相遇后迅速通過靜電作用脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變, 最終完全包裹住質(zhì)粒, 形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合體。脂復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞的途徑目前認(rèn)為有 3 種模式：與細(xì)胞質(zhì)膜融合方式、細(xì)直接滲透。其中，胞吞作用被認(rèn)為是復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞的主要機(jī)制。進(jìn)入質(zhì)粒從復(fù)合物分離出來，啟動基因轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮轉(zhuǎn)染效力。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R562.25

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2 任s

本文編號：2675297