【摘要】： 背景與目的: 急性肺損傷(ALI)是由嚴重感染、創(chuàng)傷、休克等因素引起的以炎癥反應和肺泡毛細血管膜損傷為主要病理改變,以進行性呼吸困難和頑固性低氧血癥為特征的危重癥,病情兇險,死亡率高。內毒素是ALI的首要致病因素,肺微血管內皮細胞(PMVEC)及其表達的細胞間黏附分子-1(ICAM-1)在內毒素性ALI病理過程中發(fā)揮著關鍵作用。目前臨床治療尚未取得明顯進展,呼吸支持仍是主要治療手段之一。采用全氟化碳(PFC)液體通氣,尤其是霧化吸入治療ALI較常規(guī)機械通氣(CMV)有明顯優(yōu)勢。然而,其機制尚未完全闡明,特別是PFC的抗炎效應仍有爭議,對PMVEC的保護作用及機制有待進一步探討。為此,本課題擬從器官水平觀察PFC霧化吸入對內毒素性ALI大鼠肺微血管通透性的影響,從細胞水平檢測PFC作用下脂多糖(LPS)誘導大鼠PMVEC表達ICAM-1的變化,從分子水平探討PFC對LPS激活大鼠肺微血管內皮細胞Toll樣受體4(TLR4)信號轉導通路的干預作用,旨在證實PFC的生物學抗炎效應,闡明PFC保護PMVEC的機理,從抗炎角度揭示PFC霧化吸入治療內毒素性ALI的機制,為臨床應用PFC霧化吸入治療內毒素性ALI提供更堅實的理論基礎和實驗依據。 方法: 1.采用頸靜脈注射LPS的方法復制大鼠內毒素性ALI模型,按隨機原則將64只SD大鼠分為正常對照組(N)、脂多糖致傷組(LPS)、常規(guī)機械通氣治療組(CMV)和全氟化碳霧化吸入治療組(PFC)。LPS組大鼠經頸靜脈注射6mg/kg LPS致肺損傷;兩治療組大鼠在造模成功后給予常規(guī)機械通氣,其中PFC組聯合應用PFC 10ml/kg/h霧化吸入。通氣2h并續(xù)觀6h后,采集各組大鼠標本,測定動脈血氧分壓(PaO2)和肺組織濕干重比(W/D),采用伊文思藍示蹤法檢測肺微血管通透性、鄰連茴香胺法測定肺組織MPO活性、RT-PCR法和Western Blot法分別檢測肺組織ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平,并進行肺組織病理形態(tài)學觀察。 2.采用外周肺組織貼塊法培養(yǎng)大鼠PMVEC,抽取組織塊進行切片觀察,以大鼠肺動脈平滑肌細胞和人臍靜脈內皮細胞為對照,對培養(yǎng)細胞進行CD34、植物凝集素BSI、Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學染色鑒定,通過光鏡和透射電鏡觀察細胞形態(tài)和超微結構。 3.將對數生長期的大鼠PMVEC接種于Transwell小室透明聚乙烯膜上,在內外室中加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),融合成致密單層后,隨機分為空白對照組(C)、PFC干預組(F)、LPS刺激組(L)、LPS刺激+PFC干預組(LF)。以處理0h為空白對照組,F組在Transwell外室中加入PFC進行干預,L組在Transwell內室中給予100ng/ml LPS刺激細胞,LF組在Transwell內室和外室中分別施加100ng/ml LPS和PFC進行共孵育。各處理組細胞孵育3、8、24h后,通過光鏡和MTT法分別觀測F組細胞形態(tài)和活力,采用RT-PCR法和流式細胞術(FCM)分別檢測各組細胞ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平。 4.將大鼠PMVEC培養(yǎng)于Transwell小室,融合成致密單層后,按上述方法分組和處理細胞,24h后采用FCM檢測C組、F組細胞TLR4蛋白表達水平及FITC-LPS結合量,應用Western Blot和EMSA法分別測定C組、L組、LF組細胞TRAF6、磷酸化p38MAPK蛋白表達量和NF-κB活化水平。 結果: 1.與正常對照組比較,LPS致傷組大鼠的PaO2下降、W/D比值增大、肺微血管通透性增強、肺組織MPO活性增高,肺組織ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平上調,肺組織病理形態(tài)學積分增加(P㩳0.01);CMV治療組大鼠的上述指標與LPS致傷組比較無顯著性差異(P㧐0.05);PFC霧化吸入治療組則較LPS致傷組和CMV治療組均有顯著改善(P㩳0.01-0.05)。 2.組織塊法培養(yǎng)大鼠PMVEC的綜合鑒定結果顯示:組織塊源于外周肺組織,CD34免疫細胞化學染色陽性,植物凝集素BSI結合試驗陽性,而Ⅷ因子相關抗原染色陰性,透射電鏡未見Weibel-Palade小體。 3.正常大鼠PMVEC經PFC干預3、8、24h后,細胞形態(tài)、細胞活力、ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平與C組比較無顯著性差異(P㧐0.05);L組給予LPS刺激3、8、24h后,各時相點細胞的ICAM-1 mRNA和蛋白表達量均較C組顯著增高(P㩳0.01-0.05);LF組細胞經LPS刺激和PFC干預后,與L組同時相點比較,3h組ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平無明顯差異(P㧐0.05),但8h組和24h組均有顯著降低(P㩳0.01-0.05)。 4.流式細胞術檢測結果發(fā)現,F組細胞TLR4蛋白表達水平及FITC-LPS結合量與C組比較無顯著性差異(P㧐0.05);Western Blot和EMSA測定結果顯示,L組細胞TRAF6的蛋白表達量、p38MAPK的磷酸化水平及NF-κB的結合活性均較C組顯著增高(P㩳0.01-0.05);與L組比較,LF組細胞TRAF6蛋白表達量無顯著性差異(P㧐0.05),但p38MAPK的磷酸化水平和NF-κB的結合活性均有顯著降低(P㩳0.05)。 結論: 1.全氟化碳霧化吸入對LPS誘導的大鼠ALI具有保護作用,可明顯減輕肺部炎癥反應、改善肺微血管通透性,下調肺組織ICAM-1表達、抑制PMN肺內聚集是其保護機制之一。 2.外周肺組織貼塊法是一種簡便、經濟、有效的大鼠PMVEC體外培養(yǎng)方法,Ⅷ因子相關抗原和Weibel-Palade小體并非鑒定大鼠PMVEC的理想指標,聯合應用外周肺組織切片、CD34和植物凝集素BSI三指標為組織塊法培養(yǎng)的大鼠PMVEC提供了一個簡單易行、合理、可靠的綜合鑒定方案。 3.全氟化碳不影響正常大鼠PMVEC的細胞形態(tài)和細胞活力,可通過生物學抗炎效應下調LPS誘導的肺微血管內皮細胞ICAM-1表達,進而保護PMVEC。 4.全氟化碳作用于LPS刺激的大鼠PMVEC后,既未影響細胞外LPS與TLR4的親和,也不阻斷TRAF6上游的TLR4細胞內信號轉導通路,而是通過抑制TRAF6下游NF-κB和p38MAPK的活化而干預LPS誘導PMVEC表達ICAM-1。
【圖文】：

TT 溶液： MTT，放入小燒杯中，加 50ml 0.01M PBS，攪拌溶解菌，分裝，，4℃冰箱避光保存。法微血管內皮細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定組與處理鼠 PMVEC 接種于 96 孔 Transwell 小室透明聚乙烯膜培養(yǎng)，融合成致密單層后，采用隨機數字表法把 20 、8、24h 組。各處理組細胞在 Transwell 內室中加入培行共孵育，同時設置與試驗孔平行而不加細胞只加培細胞干預相應的時間后進行指標觀測。Transwell 小室

進行多組比較，組間兩兩比較采用 q 檢驗。P㩳0.05 統(tǒng)差異非常顯著。結 果正常大鼠 PMVEC 細胞形態(tài)的影響微鏡下觀察大鼠 PMVEC，PFC 處理 3、8、24h 組與 短梭形或多角形，細胞核清晰，細胞質豐富，大小均長，細胞間仍保持緊密連接，見照片 2-9。正常大鼠 PMVEC 細胞活力的影響PMVEC 經 PFC 處理 3、8、24h 后，MTT 法測得各組）、（0.919±0.035）、（0.911±0.012），與 0h 組（0.923（P㧐0.05），各組吸光度值變化見圖 2-2。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R563

【共引文獻】

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本文編號：2672763