【摘要】：目的:肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)廣泛分布于自然界,為條件致病菌,40%～50%健康人群鼻咽部可攜帶本菌。當(dāng)機體處于免疫力低下狀態(tài)時,引起細菌性肺炎、腦膜炎、中耳炎以及敗血癥,在嬰幼兒和老年感染患者中具有一定的死亡率。據(jù)統(tǒng)計在發(fā)展中國家,每年約有120萬5歲以下的兒童死于肺炎鏈球菌引起的肺炎。肺炎鏈球菌感染性疾病的快速診斷實驗對早期對癥治療,減少抗生素的濫用,降低發(fā)病率和死亡率具有重要的意義。本研究通過基因工程技術(shù)獲取肺炎鏈球菌表面蛋白自溶素(LytA)和膽堿結(jié)合蛋白(CbpA),探討其對肺炎鏈球菌感染小鼠的血清學(xué)診斷價值,為進一步應(yīng)用于臨床診斷提供實驗基礎(chǔ)。 方法: 1.lytA和cbpA基因的原核表達及純化:根據(jù)GenBank中l(wèi)ytA和cbpA基因保守序列設(shè)計合成特異性引物,采用PCR技術(shù)從肺炎鏈球菌基因組中擴增lytA和cbpA保守序列片段;經(jīng)由IPTG誘導(dǎo)并通過等電點洗脫方法獲取純化的重組蛋白LytA和CbpA;Western blot測定表達蛋白的抗體結(jié)合活性。 2.建立細菌感染小鼠模型:肺炎鏈球菌感染實驗組及乙型鏈球菌感染對照組以血清直接凝集效價≥1:160判定為合格待測血清,用于后續(xù)ELISA測定。 3.建立ELISA反應(yīng)模式:以LytA和CbpA為抗原,建立間接ELISA反應(yīng)模式,測定感染小鼠血清中相應(yīng)的IgG和IgM抗體,評價診斷價值。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建了原核表達載體pET-32a(+)-lytA和pET-32a(+)-cbpA,表達的重組蛋白LytA和CbpA具有較好的抗體結(jié)合活性。 2.成功建立細菌感染小鼠模型,確定感染血清標(biāo)本來源的可靠性。 3.實驗組小鼠(肺炎鏈球菌感染組)IgM和IgG類抗LytA抗體滴度高于對照組(正常對照組和乙型鏈球菌感染對照組),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),CbpA抗體與正常對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與乙型鏈球菌感染組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。CbpA蛋白對感染小鼠診斷的敏感性較高(IgG:83.3%;IgM:75%),而LytA特異性較高(IgG:100%;IgM: 100%)。 結(jié)論: 1.證實了機體受肺炎鏈球菌刺激后血清中會出現(xiàn)某些抗體,可以用作血清學(xué)診斷。 2.通過基因工程技術(shù)獲取的重組蛋白LytA和CbpA具有良好的抗體結(jié)合活性,可用于血清學(xué)反應(yīng)。 3.以重組蛋白LytA和CbpA為抗原建立的ELISA反應(yīng)模式可用于檢測血清中相應(yīng)的抗體,協(xié)同利用重組蛋白CbpA診斷敏感性及LytA的特異性,對肺炎鏈球菌感染小鼠的血清學(xué)診斷具有一定價值,為進一步用于臨床診斷奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

S.P革蘭染色結(jié)果(×1000)

菌形態(tài)學(xué)檢查色和奧爾特法莢膜染色結(jié)果如圖 1-1、1-2 所示。長的球菌，鈍端相對；奧爾特法莢膜染色觀察到在。圖 1-1 S.P 革蘭染色結(jié)果(×1000)
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R563.1

【參考文獻】

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1 景巍,王轉(zhuǎn)花;一種快速純化蛋白的電洗脫方法[J];生物技術(shù);2004年02期

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本文編號：2668655