【摘要】： 研究背景及目的 支氣管哮喘(Bronchial asthma,asthma)是一種以氣道重塑、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性為表現(xiàn)的氣道慢性炎癥性疾病,許多哮喘患者的氣管中除有炎性細(xì)胞浸潤外,還存在不同程度的氣管壁結(jié)構(gòu)改變,包括主要有上皮的脫落和增生、杯狀細(xì)胞和腺體增生、上皮下膠原和細(xì)胞外基質(zhì)沉積、平滑肌肥大和增殖、血管形成、氣道軟骨減少,即氣道重塑(Airway remodeling)。炎癥介質(zhì)及炎癥細(xì)胞對(duì)氣管反復(fù)損傷和機(jī)體對(duì)損傷性刺激的修復(fù)性反應(yīng)所形成的氣管新組織結(jié)構(gòu),而氣道平滑肌細(xì)胞(Airway smooth muscle cells,ASMCs)作為氣道中數(shù)目和體積均為最大的細(xì)胞,在哮喘氣道重塑中發(fā)揮重要的作用,被認(rèn)為是哮喘氣道重塑的關(guān)鍵細(xì)胞。ASMCs的收縮、增殖、肥大、分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等促進(jìn)氣道重塑的發(fā)生發(fā)展,并進(jìn)一步加重氣道高反應(yīng)性(Airway Hyperreactivity,AHR)。 近年來國內(nèi)外的大量研究發(fā)現(xiàn),ASMCs也具有遷移的功能,這種遷移與動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)的遷移相類似,因此我們推理:哮喘時(shí)ASMCs在細(xì)胞外基質(zhì)和各種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和生長因子的聯(lián)合作用下,ASMCs向氣道內(nèi)膜定向移動(dòng)并發(fā)生增殖,導(dǎo)致氣道壁的增厚和狹窄,雖然目前還缺乏ASMCs向氣道內(nèi)膜直接遷移的證據(jù),但有研究發(fā)現(xiàn),在哮喘患者氣道活檢組織標(biāo)本中,氣道固有層內(nèi)發(fā)現(xiàn)的肌纖維母細(xì)胞在顯微結(jié)構(gòu)、形態(tài)學(xué)和位置方面都與ASMCs極其相似,提示肌纖維母細(xì)胞可能是ASMCs遷移并轉(zhuǎn)化而來,ASMCs的遷移的研究是近來的熱點(diǎn)之一,但對(duì)于ASMCs遷移的機(jī)制目前還不十分清楚。 第10號(hào)染色體缺失的與張力蛋白同源的磷酸酶基因(Phophatase and tensinhomolog deleted on chromosone 10,PTEN)是至今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因,對(duì)細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡、遷移和血管生長等許多生物學(xué)行為有重要影響,該基因的突變、失活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。2003年Youn-Geun Kwak及同事首次報(bào)道了PTEN參與支氣管哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生,PTEN蛋白的表達(dá)和活性在卵清蛋白(OVA)-誘導(dǎo)的哮喘豚鼠模型中降低,而支氣管內(nèi)應(yīng)用攜帶PTEN cDNA的腺病毒(Ad-PTEN)轉(zhuǎn)染后,哮喘鼠BAL液中IL-4、IL-5和嗜酸細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)水平下調(diào),氣道炎癥減輕。大量研究已經(jīng)證實(shí)抑癌基因PTEN可以通過對(duì)磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)及黏著斑激酶(FAK)等信號(hào)通路的抑制從而抑制腫瘤細(xì)胞、心肌和血管平滑肌等細(xì)胞的增殖、遷移,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。 而以上這些通路同時(shí)也是介導(dǎo)人ASMCs增殖、遷移等的主要信號(hào)傳導(dǎo)通路,在人ASMCs中PTEN對(duì)這些通路是否也有類似地影響,目前我們尚不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)以下兩個(gè)方面進(jìn)行研究:一)構(gòu)建攜帶野生型質(zhì)粒PTEN的腺病毒載體。二)初步探討PTEN在ASMCs遷移中的作用。 材料與方法 1、經(jīng)患者同意,取南方醫(yī)院胸外科同期做肺葉切除術(shù)患者的正常肺葉、段支氣管標(biāo)本。 2、組織塊貼壁法培養(yǎng)人支氣管平滑肌細(xì)胞(Airway smooth muscle cells,ASMCs),光鏡下觀察和α-actin細(xì)胞免疫組化進(jìn)行ASMCs鑒定。 3、構(gòu)建攜帶野生型質(zhì)粒PTEN的腺病毒載體,PCR、western blot等鑒定載體構(gòu)建的成功。 3、使用Transwell趨化小室檢測ASMCs的跨膜遷移能力的變化。 4、利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)再次檢測ASMCs遷移能力的變化。 5、FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-肌動(dòng)蛋白骨架,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察ASMCs細(xì)胞骨架的變化。 6、Western blot檢測各組(Ad-PTEN組、Ad-GFP組、DMEM空白對(duì)照組)信號(hào)通路中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)及黏著斑激酶(FAK)磷酸化水平的改變,以反應(yīng)相應(yīng)信號(hào)通路在細(xì)胞遷移中的作用。 7、采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±S)表示,各處理組間比較用析因分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、ASMCs的形態(tài)及免疫組化鑒定:倒置顯微鏡下單個(gè)ASMCs呈長梭形,貼壁生長至融合后,細(xì)胞呈現(xiàn)出特征的“峰、谷”狀形態(tài)。細(xì)胞免疫組化平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物α-actin鑒定,光鏡下可見細(xì)胞漿中較多棕黃色顆粒為染色陽性細(xì)胞。 2、重組穿梭載體質(zhì)粒、重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)過PCR酶切鑒定,得到我們所需的一條1.3 kb小片斷及酶切條帶,腺病毒經(jīng)過包裝、擴(kuò)增及滴度測定,最終用PTEN的原始質(zhì)粒特異性引物進(jìn)行PCR,從病毒液中擴(kuò)增出目的片段,大小為559 bp,因此證實(shí)腺病毒構(gòu)建成功。 3、體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可見在0h時(shí),Ad-PTEN、Ad-GFP與DMEM三組之間劃痕面積(細(xì)胞數(shù))相差不大,三組作用于ASMC 48 h后,加入刺激因子PDGF-BB組:Ad-PTEN(44.40±9.15)細(xì)胞數(shù)明顯較Ad-GFP(215.20±27.02)與DMEM(192.80±19.89)明星減少,而未加入刺激因子PDGF-BB組:Ad-PTEN(38.40±7.73)、Ad-GFP(94.40±12.05)、DMEM(83.20±7.59)。在Ad-PTEN組細(xì)胞遷移數(shù)目的減少與腺病毒本身無關(guān),而是目的基因PTEN起到抑制細(xì)胞遷移的作用(P＜0.00),因?yàn)榭詹《緦?duì)照組Ad-GFP與無病毒對(duì)照組DMEM間細(xì)胞遷移的面積相差不大(P＞0.163)。同時(shí)經(jīng)過PDGF-BB處理的三組ASMCs遷移的細(xì)胞數(shù)目較未加PDGF-BB處理明顯增加。 4、Transwell趨化小室檢測法證實(shí)腺病毒Ad-PTEN明顯能抑制ASMCs的遷移活動(dòng),Ad-PTEN作用于ASMCs時(shí)遷移細(xì)胞數(shù)目是(206.40±20.48),而Ad-GFP組與DMEM空白對(duì)照組細(xì)胞遷移的數(shù)目分別是(658.00±46.58)、(658.80±61.81),而加入刺激因子PDGF-BB后各組的細(xì)胞遷移數(shù)目分別是:Ad-PTEN(610.40±26.20)、Ad-GFP(1506.60±92.03)、DMEM(1511.20±71.66),這較不加刺激因子組有較大的促進(jìn)遷移作用,無論是否存在刺激因子,Ad-PTEN較Ad-GFP及DMEM相比,有明顯的差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.00)。說明PTEN能抑制ASMCs的遷移活動(dòng),同時(shí)再次驗(yàn)證PDGF-BB是一個(gè)促遷移因子。 5、激光共聚焦觀察細(xì)胞骨架:Ad-GFP、DMEM空白對(duì)照組細(xì)胞有少量短而細(xì)的應(yīng)力纖維,很少絲狀偽足形成,而Ad-PTEN可見細(xì)胞細(xì)胞輪廓變細(xì),偽足及應(yīng)力纖維明顯變少。Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三組加入刺激因子PDGF-BB刺激60min后,細(xì)胞即發(fā)生伸展,應(yīng)力纖維形成增多。 6、Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM處理后:(1)、磷酸化Akt(p-Akt)/總的Akt灰度值比分別為:0.059±0.001、0.503±0.001、0.502±0.001,三組間有顯著性差異(P＜0.00),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明PTEN可能通過抑制Akt通路抑制ASMCs的遷移,Ad-PTEN組p-Akt表達(dá)水平顯著減少,而兩對(duì)照組間無顯著性差異(P＞0.244)。而加入刺激因子PDGF-BB后,Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三組磷酸化Akt(p-Akt)/總的Akt灰度值比分別為:0.098±0.001、0.701±0.001、0.700±0.001,與未加刺激組同理,亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)、磷酸化ERK_(1/2)(p-ERK_(1/2))/總的ERK_(1/2)灰度值比分別為:0.745±0.002、0.743±0.002、0.744±0.002,三組間無顯著性差異(P＞0.15),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PTEN可能不是通過抑制ERK_(1/2)通路而抑制氣道平滑肌細(xì)胞的遷移。而加入刺激因子PDGF-BB后,Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三組磷酸化ERK_(1/2)(p-ERK_(1/2))/總的ERK_(1/2)灰度值比分別為:0.802±0.001、0.803±0.001、0.804±0.002,同理亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.071)。(3)、磷酸化FAK(p-FAK)/總的FAK灰度值比分別為:0.099±0.002、0.647±0.001、0.649±0.001,三組間有顯著性差異(P＜0.00),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明PTEN可能通過抑制FAK通路抑制ASMCs的遷移,Ad-PTEN組p-FAK表達(dá)水平顯著減少,而兩對(duì)照組間無顯著性差異(P＞0.767)。而加入刺激因子PDGF-BB后,Ad-PTEN、Ad-GFP及DMEM三組磷酸化FAK(p-FAK)/總的FAK灰度值比分別為:0.081±0.040、0.721±0.001、0.725±0.001。與未加刺激組同理,亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.00)。 結(jié)論 PTEN能夠通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)及黏著斑激酶(FAK)等信號(hào)通路從而抑制ASMCs的遷移,且PTEN可能通過抑制細(xì)胞骨架蛋白的改變來抑制ASMCs的遷移,這提示PTEN對(duì)氣道重塑起到很重要的抑制作用。
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3.2重組腺病毒質(zhì)粒的鑒定:根據(jù)重組后腺病毒載體的序列分析攜帶目的基因表達(dá)框的陽性克隆被Xhol酶切后應(yīng)該有以下7條帶組成(圖2):陽性克隆:14，11.8，3.9，2.66，，2.47，1.45，0.6kb。沒有攜帶PTEN基因的重組腺病毒空載體應(yīng)該由以下6條帶組成(圖2，3):陰性克隆:14

沒有攜帶PTEN基因的重組腺病毒空載體應(yīng)該由以下6條帶組成(圖2，3):陰性克隆:14，11.8，4.0，2.47，1.45，o.6kb。尸Adxsi一oFP一PTEN載體Xho酶切鑒定結(jié)果，見圖2。pAdxsi空載體Xho廊切鑒定結(jié)果，見圖3。﨑

本文編號(hào)：2630210