【摘要】： 在工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的異氰酸鹽是甲苯二異氰酸鹽(Toluene Diisocyana,TDI),是引起職業(yè)性哮喘最常見(jiàn)的原因。暴露TDI環(huán)境的工人,約有5%-15%發(fā)展為哮喘,明顯高于普通人群,且誘發(fā)的哮喘經(jīng)常發(fā)展為重癥哮喘。TDI哮喘的病理和臨床表現(xiàn)基本上與過(guò)敏性哮喘相同,但針對(duì)TDI哮喘的發(fā)病機(jī)制研究還比較局限,很多環(huán)節(jié)尚不清,對(duì)其機(jī)制尤其是啟動(dòng)機(jī)制的了解是對(duì)TDI哮喘能夠達(dá)到很好地診斷和治療的關(guān)鍵步驟。目前的研究提示TDI誘發(fā)哮喘的主要作用環(huán)節(jié)有兩個(gè):其一是支氣管上皮細(xì)胞作為主要靶細(xì)胞,TDI對(duì)支氣管上皮細(xì)胞的作用,可能導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的失常和生物活性因子的釋放,在TDI哮喘中扮演重要角色;其二是氣道粘膜下的抗原提呈細(xì)胞(如樹(shù)突狀細(xì)胞),TDI與體內(nèi)形成的大分子如TDI-HSA滲透到粘膜下組織被抗原提呈細(xì)胞提呈后產(chǎn)生活性物質(zhì),這些活性物質(zhì)與支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子一同活化淋巴細(xì)胞(包括Th1和Th2)、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞,從而引起下游一系列炎癥反應(yīng)。最近Lee等研究表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)在TDI哮喘扮演關(guān)鍵角色,但TDI是否可直接作用于人支氣管上皮細(xì)胞(Humanbronchious epithelial cell,HBE)致VEGF表達(dá)增加,進(jìn)而起動(dòng)和促發(fā)氣道炎癥,引起氣道高反應(yīng)性的作用,尚不清楚。TDI-HSA等大分子抗原必須穿透支氣管上皮細(xì)胞為主組成的粘膜屏障才可作用于抗原提呈細(xì)胞,然而工業(yè)環(huán)境中允許的低濃度TDI是不會(huì)直接引起上皮細(xì)胞損害,TDI是否通過(guò)影響HBE通透性導(dǎo)致哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展還有待于進(jìn)一部闡明。 所以本課題從兩個(gè)不同方面研究TDI對(duì)HBE的作用來(lái)初步探討TDI哮喘發(fā)病機(jī)制。 課題第一部分:甲苯二異氰酸鹽(TDI)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響 方法: 1)制備TDI抗原結(jié)合物:應(yīng)用改良的Son M方法制備TDI-人血清白蛋白(TDI-HSA)。 2)觀(guān)察不同濃度的TDI-HSA和HSA對(duì)正常人支氣管上皮細(xì)胞株HBE135-E6E7細(xì)胞活力影響:觀(guān)察TDI-HSA對(duì)細(xì)胞活力影響時(shí)分為:對(duì)照組(不加TDI-HSA只以無(wú)血清培養(yǎng)基孵育),20μg/mlTDI-HSA組,40μg/mlTDI-HSA組,60μg/mlTDI-HSA組,80μg/mlTDI-HSA組,100μg/mlTDI-HSA組(n=7);觀(guān)察HSA對(duì)細(xì)胞活力影響時(shí)分為:對(duì)照組(不加HSA只以無(wú)血清培養(yǎng)基孵育HBE135-E6E7組),20μg/mlHSA組,40μg/mlHSA組,60μg/mlHSA組,80μg/mlHSA組,100μg/mlHSA組(n=8)。按上述分組刺激HBE135-E6E7 48小時(shí)后,用四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞活力。 3)觀(guān)察不同濃度TDI-HSA對(duì)HBE135-E6E7 VEGF基因的影響:實(shí)驗(yàn)分成9組:對(duì)照組(不加HSA及TDI-HSA只以無(wú)血清培養(yǎng)基孵育),10μg/mlHSA組,20μg/mlHSA組,30μg/mlHSA組,40μg/mlHSA組,10μg/mlTDI-HSA組,20μg/mlTDI-HSA組,30μg/ml TDI-HSA組,40μg/ml TDI-HSA組(n=4)。按上述分組刺激HBE135-E6E7 12小時(shí)后,提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用半定量RT-PCR方法檢測(cè)HBE135-E6E7 VEGFmRNA。 4)觀(guān)察地塞米松對(duì)TDI-HSA誘導(dǎo)HBE135-E6E7 VEGF表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)分為4組:對(duì)照組(不加HSA及TDI-HSA只以無(wú)血清培養(yǎng)基孵育),40μg/ml HSA組,40μg/ml TDI-HSA組,(40μg/ml TDI-HSA+1umol/L地塞米松)組,按上述分組刺激HBE135-E6E7 12小時(shí)后,提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用半定量RT-PCR方法檢測(cè)HBE135-E6E7 VEGF mRNA(n=4);刺激HBE135-E6E7 24小時(shí)后,用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)各組上清液VEGF蛋白濃度(n=7)。 5)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差((?)±S)表示,不同組間用One Way ANOVA進(jìn)行單變量方差分析,多重比較采用LSD法。 結(jié)果: 1) MTT比色法檢測(cè)不同濃度的TDI-HSA和HSA對(duì)HBE135-E6E7活力結(jié)果: 在TDI-HSA濃度分別為20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml組對(duì)HBE135-E6E7細(xì)胞活力無(wú)顯著影響,100μg/ml則可顯著降低細(xì)胞活力(P0.001):HSA組:20μg/ml和40μg/ml組對(duì)HBE135-E6E7細(xì)胞活力無(wú)顯著影響),當(dāng)濃度增至60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml則增加細(xì)胞活力(P均0.05)。 2) RT-PCR法檢測(cè)不同濃度TDI-HSA對(duì)HBE135-E6E7 VEGF基因的影響結(jié)果: HBE135-E6E7組成性表達(dá)VEGF189、VEGFl65亞型基因,以VEGF165表達(dá)量較多。HBE135-E6E7 VEGF189基因和VEGF165基因在10μg/mlTDI-HSA組與10μg/ml HSA組以及對(duì)照組相比表達(dá)增加,但無(wú)顯著差異(P均0.05),在20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的TDI-HSA組與相應(yīng)濃度的HSA組以及對(duì)照組相比,兩亞型基因均表達(dá)顯著增加(P均0.05),且隨著TDI-HSA濃度的增加表達(dá)亦隨之增加(P均0.05);兩亞型基因在不同濃度HSA組之間表達(dá)無(wú)顯著差異(P均0.05),各濃度HSA組與對(duì)照組比較亦無(wú)顯著差異(P均0.05)。 3) RT-PCR、雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)地塞米松對(duì)TDI-HSA誘導(dǎo)HBE135-E6E7VEGF表達(dá)的影響結(jié)果: HBE135-E6E7 VEGF189基因和VEGFl65基因在TDI-HSA組與對(duì)照組以及HSA組比較均顯著增加(P均0.001),(TDI-HSA+地塞米松)組與TDI-HSA組比較無(wú)顯著差異(P0.05);上清VEGF蛋白濃度在TDI-HSA紐與對(duì)照組以及HSA組比較增加3倍以上(P均0.001),(TDI-HSA+地塞米松)組與TDI-HSA組比較無(wú)顯著差異(P0.05),對(duì)照組與HSA組上清VEGF濃度比較無(wú)顯著差異(P0.05)。 結(jié)論: TDI-HSA在不影響細(xì)胞活力情況下以40μg/ml濃度時(shí)對(duì)HBE VEGF基因表達(dá)影響最大,并具有濃度依賴(lài)性。TDI在基因和蛋白水平上均可顯著上調(diào)HBEVEGF的表達(dá),且不能被地塞米松所抑制。 課題第二部分:甲苯二異氰酸鹽(TDI)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞間通透性的影響及機(jī)制探討 方法: 分組:對(duì)照組(不加HSA及TDI-HSA只以無(wú)血清培養(yǎng)基孵育),40μg/mlHSA組,40μg/ml TDI-HSA組,(40μg/ml TDI-HSA+0.02μg/mlVEGF)中和抗體組;按上述分組刺激HBE135-E6E7細(xì)胞24小時(shí)后,用FITC-右旋糖酐檢測(cè)細(xì)胞間通透性(n=6),用透視電鏡觀(guān)察細(xì)胞間間隙(n=3)。 結(jié)果: 1) FITC-右旋糖酐檢測(cè)TDI-HSA對(duì)HBE135-E6E7細(xì)胞間通透性的影響及VEGF通路在其中的介導(dǎo)作用: 細(xì)胞間通透性在TDI-HSA組與對(duì)照組以及HSA組比較增加2倍以上(P均0.001),在(TDI-HSA+VEGF中和抗體)組與TDI-HSA組比較有所下降(P0.001),(TDI-HSA+VEGF中和抗體)組與對(duì)照組以及HSA組比較亦有顯著差異(P均0.001),對(duì)照組與HSA組細(xì)胞間通透性比較無(wú)顯著差異(P0.05)。 2)透視電鏡觀(guān)察TDI-HSA對(duì)HBE135-E6E7細(xì)胞間間隙及VEGF及VEGF通路在其中的介導(dǎo)作用: TDI-HSA組可見(jiàn)細(xì)胞間局部連接疏松,緊密連接變少,見(jiàn)明顯空隙,(TDI-HSA+VEGF中和抗體)組仍可見(jiàn)細(xì)胞間局部連接疏松,見(jiàn)明顯空隙,對(duì)照組和HSA組的細(xì)胞間連接緊密,未見(jiàn)明顯孔隙。 結(jié)論: TDI明顯增加HBE間的通透性,加入VEGF中和抗體可部分逆轉(zhuǎn)TDI引起的HBE間通透性增加,TDI可能通過(guò)破壞支氣管上皮細(xì)胞的緊密連接導(dǎo)致通透性的增加,而VEGF中和抗體不能逆轉(zhuǎn)其緊密連接的改變。
【圖文】：

nnassay定性與定量檢測(cè)TDI·HSA中TDI濃度圖右為空白調(diào)零孔，其余為不同濃度的對(duì)甲苯胺標(biāo)準(zhǔn)品，第A(yíng)孔。ntofisocyanateboundtoHSAdeterminedbymedi五皮細(xì)胞株HBEI35一E6E7的形態(tài)觀(guān)察鏡下觀(guān)察，可見(jiàn)HBE135一E6E7細(xì)胞呈不規(guī)瓶，當(dāng)細(xì)胞匯聚成單層細(xì)胞時(shí)，，呈鋪路石。

測(cè)不同濃度TDI一HSA和HSA對(duì)HBE135一E6E7胞作用產(chǎn)生棕色結(jié)晶物質(zhì)(見(jiàn)圖3)。細(xì)胞活力氣值)/(不加藥對(duì)照組A值一不加細(xì)胞組A值)度分別為Zop歲ml、40pg/ml、60pg/mlE7細(xì)胞活力無(wú)顯著影響，當(dāng)其增加至100pg/1);在HsA組:20pg/ml組和40pg/inl組HB影響，其后隨著濃度增加至60pg/ml、80pg/力(P均<0.05)。(見(jiàn)表1、表2、圖4、圖5)0pg/ml、30pglinl、40pg/Inl的HSA和TD察不同濃度TDI一SA對(duì)HBE135一E6E7VEGF
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R562

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2625081