【摘要】： 研究背景 糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids, GC)具有廣泛的抗炎和免疫抑制作用,是治療哮喘、慢性阻塞型肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease , COPD)及肺纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病的一種常見(jiàn)藥物。糖皮質(zhì)激素與糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoids receptor,GR)結(jié)合后進(jìn)入核內(nèi),發(fā)揮抗炎作用。GRα和GRβ系GR基因經(jīng)過(guò)不同的剪接途徑產(chǎn)生兩種主要的剪接異構(gòu)體,其中GRα的表達(dá)水平和功能狀態(tài)是影響GC發(fā)揮抗炎效應(yīng)的主要因素。 有關(guān)GC作用的分子生物學(xué)機(jī)制已經(jīng)有了較為深入透徹的研究,但是以往這些研究多是在常氧狀態(tài)上進(jìn)行的,GC在人體內(nèi)發(fā)揮作用是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,機(jī)體的功能狀態(tài)和人體細(xì)胞所處的微環(huán)境可能影響GC的各項(xiàng)作用。Leonard等研究發(fā)現(xiàn),低氧可上調(diào)人近端腎小管上皮細(xì)胞GR的表達(dá)并增加GC的敏感性。低氧是哮喘、COPD等呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)作時(shí)常常伴有的一種病理生理狀態(tài),低氧是否可以調(diào)節(jié)人體氣道細(xì)胞的GR表達(dá)并影響GC抗炎效應(yīng)尚不明確。 目的 本研究以人肺泡上皮A549細(xì)胞為模型,觀察低氧對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)及增殖周期的影響;研究低氧對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞GRα和GRβ的表達(dá)的影響;研究低氧對(duì)地塞米松抑制LPS刺激人肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生的IL-8的效應(yīng)的影響。 方法 1.A549細(xì)胞低氧培養(yǎng) 人肺泡上皮A549細(xì)胞放入普通培養(yǎng)箱(37℃, 95%空氣、5% CO2,常氧)和低氧小室(37℃,95%N2、25 % CO2,低氧)分別培養(yǎng)24h,48h,72h。 2.微分干涉顯微鏡(DIC)觀察低氧對(duì)人肺泡上皮A549細(xì)胞形態(tài)的影響將細(xì)胞分別種于6個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中,24h后更換培養(yǎng)基,再分別常氧和低氧條件下培養(yǎng)24h,48h,72h。DIC拍攝觀察低氧和常氧各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)的改變。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)低氧對(duì)人肺泡上皮A549細(xì)胞增殖周期的影響將細(xì)胞分別種于35mm的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁后再更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,以達(dá)到各組細(xì)胞生長(zhǎng)周期同步化,然后再分別低氧和常氧培養(yǎng)48h,收集細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期的變化。 4.RT-PCR檢測(cè)低氧對(duì)人肺泡上皮A549細(xì)胞GRα和GRβ的mRNA表達(dá)的影響細(xì)胞常氧和低氧條件下分別培養(yǎng)24h,48h,72h,收集細(xì)胞抽取總RNA,然后RT-PCR法分別檢測(cè)各組細(xì)胞GRα和GRβ的mRNA表達(dá)的變化 5. Western Blot檢測(cè)低氧對(duì)人肺上皮A549細(xì)胞GRα和GRβ的蛋白表達(dá)的影響。細(xì)胞常氧和低氧條件下分別培養(yǎng)24h,48h,72h,收集細(xì)胞提取總蛋白,然后Western Blot法分別檢測(cè)各組細(xì)胞GRα和GRβ的蛋白表達(dá)的變化。 6.放射免疫法檢測(cè)低氧對(duì)地塞米松抑制LPS刺激產(chǎn)生的IL-8的影響將細(xì)胞調(diào)整至合適密度種于24孔板中,待第二天細(xì)胞貼壁且呈基本融合狀態(tài)時(shí),棄去之前的完全培養(yǎng)基,用PBS洗兩遍后,換成無(wú)血清的培養(yǎng)基,并在培養(yǎng)基中加入LPS(10ug/ml)和不同濃度的地塞米松(10-8M-10-6M),分別低氧和常氧培養(yǎng)48h,然后收集細(xì)胞上清,用放射免疫法檢測(cè)上清中的IL-8水平。 7.統(tǒng)計(jì)方法 所有試驗(yàn)至少分4次獨(dú)立完成,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。多組間的差異用one-way ANOVA分析,兩組之間的差異用t檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)在SPSS 10.0軟件統(tǒng)計(jì)包中進(jìn)行,P0.05表示差異有顯著性。 結(jié)果 1.低氧時(shí)間依賴性的引起人肺泡上皮A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 用DIC方法分別拍攝24h、48h、72h常氧和低氧條件下培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)現(xiàn):低氧24h組細(xì)胞形態(tài)較常氧24h組無(wú)明顯改變;而低氧48h組的細(xì)胞與常氧48h組細(xì)胞相比,細(xì)胞變大,扁平,邊界模糊,細(xì)胞密度減低;低氧72h組的細(xì)胞與常氧72h組的細(xì)胞相比,這種變化趨勢(shì)更加明顯。 2.低氧導(dǎo)致人肺泡上皮A549細(xì)胞增殖受阻 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn):低氧48h組的細(xì)胞,處于G1期的為88.2±0.82%,而常氧48h組的細(xì)胞處于G1期為78.2±0.64%,在低氧48h組處于G1期的細(xì)胞比例明顯大于常氧48h組G1期的細(xì)胞比例,說(shuō)明低氧引起了人肺泡上皮A549細(xì)胞增殖受阻。 3.低氧時(shí)間依賴性的導(dǎo)致人肺泡上皮A549細(xì)胞GRα表達(dá)下降 RT-PCR和Western Blot結(jié)果均表明:低氧24h組和常氧24h組相比,GRα表達(dá)的mRNA和蛋白水平無(wú)明顯改變;而低氧48h組的細(xì)胞與常氧48h組細(xì)胞相比,GRα表達(dá)的mRNA和蛋白水平明顯下降;低氧72h組的細(xì)胞與常氧72h組細(xì)胞相比,GRα表達(dá)下降更加明顯。而且,低氧24h、48h、72h組的細(xì)胞, GRα表達(dá)的mRNA和蛋白水平呈進(jìn)行性下降,說(shuō)明低氧可時(shí)間依賴性的導(dǎo)致人肺泡上皮細(xì)胞GRα的表達(dá)下降。 4.低氧對(duì)人肺泡上皮A549細(xì)胞GRβ的表達(dá)無(wú)明顯影響 RT-PCR和Western Blot結(jié)果表明:24h、48h、72h組常氧組和低氧細(xì)胞組相比, GRβ的表達(dá)的mRNA和蛋白水平均無(wú)明顯改變。而且,低氧24h、48h、72h組細(xì)胞, GRβ表達(dá)的mRNA和蛋白水平也無(wú)明顯改變,說(shuō)明低氧對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞GRβ的表達(dá)無(wú)明顯影響。 5.低氧導(dǎo)致地塞米松在人肺泡上皮細(xì)胞抑制IL-8的效應(yīng)減弱 放射免疫法結(jié)果表明, 48h低氧培養(yǎng)的DEX+LPS組細(xì)胞上清的IL-8水平在10-7M和10-6M DEX濃度時(shí),均高于相應(yīng)的常氧下的DEX+LPS組細(xì)胞。而且,在低氧時(shí),達(dá)到最大抑制效應(yīng)的DEX濃度為10-7M;而在常氧時(shí),提高DEX濃度至10-6還可以繼續(xù)增加DEX的抑制效應(yīng),說(shuō)明在人肺泡上皮A549細(xì)胞,低氧可導(dǎo)致DEX抑制IL-8的抗炎效應(yīng)減弱。 結(jié)論 1.低氧時(shí)間依賴性的引起人肺泡上皮A549細(xì)胞形態(tài)改變; 2.低氧導(dǎo)致人肺泡上皮A549細(xì)胞增殖受阻; 3.低氧時(shí)間依賴性的導(dǎo)致人肺泡上皮A549細(xì)胞GRα表達(dá)下降,而對(duì)人肺泡上皮A549細(xì)胞GRβ的表達(dá)無(wú)明顯影響; 4.低氧導(dǎo)致DEX在人肺泡上皮細(xì)胞的抗炎效應(yīng)減弱。
【圖文】：

間依賴性的導(dǎo)致人肺泡上皮 A549 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變用 DIC 的方法分別拍攝了常氧和低氧培養(yǎng) 24h，48h 和示：低氧 24h 培養(yǎng)和常氧 24h 培養(yǎng) A549 細(xì)胞的相比，均勻，形態(tài)無(wú)明顯改變；而低氧 48h 培養(yǎng)和常氧 48h 培胞明顯脹大，細(xì)胞不再呈橢圓球狀突起，而變得扁平，界變得模糊不清，，細(xì)胞密度降低；低氧到了 72h 時(shí)，。

of the cells became bleared compared to the cells in normoxic conditions and the difference becamemore obvious till 72h.. The morphological alteration in cells was captured by DIC.注：“24-N”代表 24 小時(shí)對(duì)照組，“24-H”代表 24 小時(shí)低氧組；“48h-N”代表 48 小時(shí)對(duì)照組，“48h-H”代表 48 小時(shí)低氧組；“72h-N”代表 48 小時(shí)對(duì)照組，“72h-H”代表 72 小時(shí)低氧組。3.2 低氧導(dǎo)致人肺泡上皮 A549 細(xì)胞增殖受阻流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)低氧和常氧 48h 分別培養(yǎng)的 A549 細(xì)胞的細(xì)胞增殖周期，結(jié)果顯示：低氧時(shí)，88.2±0.82%(n =3)的細(xì)胞在 G1 期，而常氧時(shí)，79.2±0.64% (n =3)的細(xì)胞在 G1 期，在低氧 48h 時(shí)處于 G1 期的細(xì)胞比例明顯大于常氧 48h 時(shí) G1 期的細(xì)胞比例( P<0.01)，低氧時(shí)細(xì)胞發(fā)生了明顯的 G1 期阻滯。這說(shuō)明低氧 48h 可顯著地抑制人肺泡上皮細(xì)胞 A549 的增殖。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R563;R96

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本文編號(hào)：2612435