本文關(guān)鍵詞：MiRNA-646在脂多糖處理后的A549細(xì)胞中的表達(dá)及功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指膿毒癥、重癥肺炎、多發(fā)傷等肺內(nèi)外疾病侵襲機(jī)體后出現(xiàn)的炎性因子大量釋放,肺泡上皮細(xì)胞損傷及肺表面活性物質(zhì)合成減少為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。其臨床特征包括呼吸頻速和呼吸窘迫,進(jìn)行性低氧血癥,X線呈現(xiàn)彌漫性肺浸潤影。雖然治療手段在不斷增加,但ARDS現(xiàn)在仍是PICU中威脅人類生命的重要原因之一。據(jù)統(tǒng)計,美國每年有19萬的ARDS病人,死亡率高達(dá)39.4%；而我國的死亡率更高,達(dá)到71.4%�，F(xiàn)階段ARDS的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了,但是在ARDS時肺表面活性物質(zhì)合成是減少的。Schmidt等發(fā)現(xiàn)在ARDS患者的肺泡灌洗液中肺表面活性蛋白A(surfactant associated protein A, SP-A)、肺表面活性蛋白B(surfactant associated protein B, SP-B)、肺表面活性蛋白C(surfactant associated protein C, SP-C)、二棕櫚酰卵磷脂明顯減少,隨著ARDS的好轉(zhuǎn),它們的量相應(yīng)的增加。在嚴(yán)重的ARDS病人給予SP-C后,能夠明顯的減輕缺氧,減少死亡率。 microRNA (miRNA)廣泛存在于真核生物中,是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能,它能對細(xì)胞的生長、分化、凋亡及關(guān)鍵蛋白的分泌等各個層面進(jìn)行調(diào)節(jié)。多種miRNA在同一個細(xì)胞中的表達(dá)使得細(xì)胞處在一種內(nèi)在的miRNA環(huán)境中,這個環(huán)境控制著成千上萬的編碼基因的mRNA,使得各種蛋白的表達(dá)處在一個合適的水平,調(diào)控各種關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)。 現(xiàn)階段人們越來越重視miRNA和肺部疾病的關(guān)系的研究,人們已經(jīng)對miRNA和肺的生長發(fā)育、肺纖維化、肺部腫瘤、肺部炎癥等方面進(jìn)行了研究,并且證實了miRNA參與了上述的生命活動。ARDS的發(fā)病機(jī)制仍未完全明了,缺乏有效的治療手段,miRNA在ARDS發(fā)生發(fā)展過程中的作用越來越引起人們的重視。miRNA機(jī)制的研究可能是基因、蛋白水平有關(guān)ARDS/ALI發(fā)病機(jī)制及治療研究的重要補(bǔ)充。目前對ARDS發(fā)病機(jī)制方面的報道很少涉及miRNA, ARDS時在miRNA水平有什么變化?我們通過miRNA芯片檢測損傷前和損傷后的A549細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的miRNA。我們進(jìn)一步對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因的預(yù)測,發(fā)現(xiàn)miRNA的靶基因和肺表面活性相關(guān)蛋白、肺的生長發(fā)育、炎癥、細(xì)胞凋亡、腫瘤等方面相關(guān)。我們選擇了和肺表面活性相關(guān)蛋白相關(guān)的miRNA-646(miR-646)進(jìn)行下面的實驗,進(jìn)一步探討miR-646在實驗中的變化,預(yù)測miR-646的靶基因,進(jìn)一步完善ARDS的發(fā)病機(jī)制,為ARDS的治療提供新的靶點。 目的 1.檢測A549細(xì)胞通過脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)處理前后SP-A、 SP-C表達(dá)量的變化。 2.通過微陣列芯片技術(shù)測定LPS處理A549細(xì)胞前后miRNA的差異表達(dá)譜,確定進(jìn)行下面實驗的差異表達(dá)的目標(biāo)miRNA和目標(biāo)靶基因。 3.探討miRNA參與ARDS發(fā)生發(fā)展過程中可能的機(jī)制,為ARDS的診治尋找新的靶點。 方法 1.實驗分為實驗組及對照組,對照組是以RPMI-1640培養(yǎng)液處理A549細(xì)胞24小時；實驗組分別以5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml的LPS處理A549細(xì)胞24小時。通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色、western blot法檢測各組細(xì)胞中的SP-A、 SP-C的表達(dá)量。并用RT-PCR方法檢測各組細(xì)胞中SP-A、SP-C的mRNA的表達(dá)量。 2.利用miRNA基因芯片檢測10μg/ml的LPS處理前后A549細(xì)胞,找出其中差異表達(dá)大的miRNA。利用生物信息學(xué)軟件(TargetScan, miRanda,Clip-seq, miRDB)預(yù)測差異表達(dá)大的miRNA的靶基因,找到一個靶基因蛋白在ARDS發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用的目標(biāo)靶基因,確定目標(biāo)miRNA和目標(biāo)靶基因。并用實時熒光定量PCR的方法檢測各組細(xì)胞中目標(biāo)miRNA的表達(dá)量,驗證基因芯片的準(zhǔn)確性。并做目標(biāo)miRNA的表達(dá)和目標(biāo)靶基因蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析。 3.體外驗證目標(biāo)miRNA對目標(biāo)靶基因蛋白的的調(diào)控作用。實驗分為五組,分別為mock組、miRNA mimics組、miRNA mimics control組、miRNA inhibitor組、miRNA inhibitor control組。mock組轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞時候加miRNA mimics,不加轉(zhuǎn)染劑；余各組轉(zhuǎn)染時候A549細(xì)胞液分別轉(zhuǎn)染miRNA mimics、miRNA mimics control、miRNA inhibitor、miRNA inhibitor control。轉(zhuǎn)染24小時后做實時熒光定量PCR驗證各組細(xì)胞中目標(biāo)miRNA的表達(dá)量,驗證轉(zhuǎn)染效果。最后用western blot法檢測各組細(xì)胞中的靶基因蛋白的表達(dá)量。 結(jié)果 1.各組細(xì)胞中SP-A、SP-C的表達(dá)量 1.1LPS處理前A549細(xì)胞形態(tài)為多角形,胞質(zhì)飽滿,有胞質(zhì)突起,呈貼壁生長,長滿時融合成片,無核固縮的現(xiàn)象。LPS處理細(xì)胞24h后,A549細(xì)胞形態(tài)變圓,體積縮小,胞質(zhì)變空亮,且胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等的顆粒。 1.2免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測各組A549細(xì)胞SP-A、SP-C的表達(dá)量SP-A在對照組的相對表達(dá)量是0.0754±0.0009,在5μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.0707±0.0019,在10μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.0424±0.0028,在15μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.0155±0.0019,實驗組和對照組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=534.498, P0.05)。SP-C在對照組的相對表達(dá)量是0.0508±0.0035,在5μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.0268±0.0035,在10μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.0148±0.0025,在15μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.0226±0.0035,實驗組和對照組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=68.388,P0.05)。 1.3western blot檢測各組A549細(xì)胞SP-A、SP-C的表達(dá)量LPS處理細(xì)胞24h后western blot檢測SP-A的表達(dá)量實驗組較對照組均下降,P0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義,且隨著脂多糖濃度的增加,SP-A的表達(dá)量越低,呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。western blot檢測SP-C的表達(dá)量實驗組較對照組均下降,P0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義,10μg/ml脂多糖處理組SP-C的表達(dá)量最低。 1.4實時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞SP-A、SP-C的mRNA的表達(dá)量SP-A的mRNA在對照組的相對表達(dá)量是1.0509±0.0368,在5μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.9333±0.0146,在10μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.5630±0.0097,在15μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.2636±0.0248,實驗組和對照組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=676.753, P0.01)。SP-C的mRNA在對照組的相對表達(dá)量是1.0442±0.1559,在5μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.5039±0.0175,在10μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.2306±0.0574,在15μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是0.3987±0.0084,實驗組和對照組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.635,P0.01)。 以上結(jié)果表明在實驗組中各組細(xì)胞的SP-A、SP-C的表達(dá)量較對照組均下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),這和在臨床上ARDS時SP-A、SP-C的表達(dá)是一致的。 2.芯片結(jié)果和確定目標(biāo)miRNA、靶基因 2.1miRNA芯片檢測結(jié)果顯示：篩選出處理前后2倍以上表達(dá)差異的miRNAs:表達(dá)顯著上調(diào)的有31個,其中表達(dá)差異最大的兩個為miR-646、 miR-1247-3p, miR-646差異達(dá)3.4倍,miR-1247-3p差異達(dá)3.2倍：顯著下調(diào)的有13個,其中表達(dá)差異最大的兩個為miR-4455、miR-374b-5p, miR-4455下調(diào)至0.32倍,miR-374b-5p下調(diào)至0.36倍。并用TargetScan, miRanda, Clip-seq, miRDB對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測。4個軟件預(yù)測miR-646共有512個靶基因,其中四個軟件共有的靶基因有176個。在共有靶基因中發(fā)現(xiàn)一個候選靶基因為sftpc,它編碼的蛋白為SP-C。SP-C在ARDS發(fā)病過程中起重要作用。所以確定進(jìn)行下面實驗的目標(biāo)miRNA為miR-646,確定目標(biāo)靶基因蛋白為SP-C。 2.2實時熒光定量PCR的方法檢測各組細(xì)胞中miR-646的表達(dá)量結(jié)果顯示對照組miR-646的表達(dá)量是0.9597±0.020,5μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是1.6319±0.1325,10μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是2.4762±0.1380,15μg/ml脂多糖處理組的相對表達(dá)量是1.6642±0.0938。實驗組和對照組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),其中10μg/ml組的相對表達(dá)量最高。這和miRNA芯片結(jié)果是一致的,驗證了芯片的準(zhǔn)確性。 2.3對miR-646的表達(dá)量和SP-C的表達(dá)量的相關(guān)性分析：脂多糖處理A549細(xì)胞后,miR-646的表達(dá)量和SP-C的表達(dá)量有顯著相關(guān)性(P0.05),并且呈明顯的濃度依賴的負(fù)相關(guān)(pearson相關(guān)系數(shù)r=—0.916)。 3.在體外驗證在mi R-646對SP-C的調(diào)控作用 3.1轉(zhuǎn)染48小時后在熒光顯微鏡下觀察見到細(xì)胞胞漿中有綠色熒光。收集細(xì)胞后對各組細(xì)胞做實時熒光定量PCR顯示：mock組miR-646的相對表達(dá)量是256.85±90.12, miR-646mimics組miR-646的相對表達(dá)量是194215.66±12555.57,miR-646mimics control組miR-646的相對表達(dá)量是145.99±22.40,miR-646inhibitor組miR-646的相對表達(dá)量是1.04±0.23,miR-646inhibitor control組miR-646的相對表達(dá)量是173.59±15.94。miR-646mimics組、miR-646inhibitor組和mock組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示轉(zhuǎn)染成功。 3.2western blot檢測轉(zhuǎn)然后各組A549細(xì)胞中SP-C的表達(dá)量。與mock組相比,miR-646mimics組SP-C的表達(dá)量明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與mock組相比,miR-646inhibitor組SP-C的表達(dá)量明顯上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與mock組相比,miR-646mimics control組、miR-646inhibitor control組SP-C的表達(dá)量無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1.A549細(xì)胞經(jīng)過LPS處理后SP-A、SP-C的表達(dá)量均下降,這和臨床的結(jié)果是一致的。 2.miR-646可能通過抑制SP-C的翻譯,在ARDS過程中發(fā)揮它的生物學(xué)功能。
【關(guān)鍵詞】：miR-646 急性呼吸窘迫綜合癥 肺表面活性蛋白C A549細(xì)胞 轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R563.9
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-26
• 參考文獻(xiàn)22-26
• 第一部分 SP-A、SP-C在脂多糖處理后的A549細(xì)胞中的變化26-54
• 一、材料與方法26-44
• 二、結(jié)果44-51
• 三、討論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 第二部分 MIR-646功能分析54-79
• 一、材料與方法54-66
• 二、結(jié)果66-74
• 三、討論74-77
• 參考文獻(xiàn)77-79
• 全文小結(jié)79-80
• 在讀期間發(fā)表論文發(fā)表情況80-81
• 致謝81-83

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7 孫n

本文編號：254371