【摘要】：研究背景 機(jī)械通氣是重要的生命支持手段也會(huì)導(dǎo)致并發(fā)癥急性肺損傷,即機(jī)械通氣所致肺損傷(centilator-induced lung,VILI),加重免疫系統(tǒng)功能的紊亂,影響呼吸窘迫綜合征等重癥患者預(yù)后。但機(jī)械通氣致肺損傷作用機(jī)制有待探討。因此,開展VILI機(jī)制研究,對(duì)探尋防治VILI的措施、改善患者預(yù)后具有重要意義。 研究表明固有免疫在機(jī)械通氣所致肺損傷過程中發(fā)揮重要作用,明確機(jī)械通氣引發(fā)的免疫效應(yīng)及其分子機(jī)制對(duì)于VILI的預(yù)防和治療至為關(guān)鍵。機(jī)械牽張誘發(fā)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的釋放,最終導(dǎo)致彌漫性肺泡的損害,病理特征包括滲透性的肺水腫、透明膜的形成以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、促炎因子釋放等。 肺泡巨噬細(xì)胞(AMs)是重要的靶細(xì)胞,肺泡巨噬細(xì)胞消減可以明顯改善機(jī)械通氣所致肺損傷。肺泡巨噬細(xì)胞大約占肺泡腔外周細(xì)胞數(shù)的5%左右,機(jī)械通氣可以快速激活A(yù)Ms并可能在VILI發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,其中包含促炎細(xì)胞因子白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和IL-18釋放,IL-1p受體拮抗劑和抗IL-1p抗體都可以減輕患者急性肺損傷炎性反應(yīng)。促炎細(xì)胞因子IL-1p和IL-18是機(jī)械通氣肺損傷肺部炎癥的明確標(biāo)記。 IL-1β和IL-18產(chǎn)生與炎性體的激活有密切關(guān)聯(lián)。炎性體(Inflammasome)是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體,可以調(diào)節(jié)固有免疫系統(tǒng)應(yīng)激反應(yīng)。主要的炎性體有：NLRP1、NLRP3、NLRC4、IPAF、AIM2炎性體等。其中NLRP3炎性體可感知傷害性刺激信號(hào)而被激活,傷害性刺激包括組織損傷、代謝、應(yīng)激、感染等,現(xiàn)在己知其參與了多種無菌性炎性疾病進(jìn)程。NLRP3炎性體復(fù)合體被激活后進(jìn)一步激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-1,后者的成熟體通過蛋白水解作用切割加工促炎細(xì)胞因子pro-IL-1β(?)(?)pro-1L-18成熟并促進(jìn)它們分泌。然而,機(jī)械力被細(xì)胞感受以及被轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)并傳導(dǎo)入細(xì)胞的機(jī)制、機(jī)械通氣導(dǎo)致IL-1β和IL-18釋放機(jī)制尚不明確,本文首次探討了NLRP3炎性體機(jī)械牽張肺損傷的調(diào)節(jié)作用。 我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示,機(jī)械牽張可以促使線粒體ROS產(chǎn)生。研究表明抑制或清除ROS可明顯抑制NLRP3的激活。最初的假設(shè)是ROS來源于吞噬相關(guān)NADPH氧化酶ROS,但是隨后的研究表明NADPH基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)中,NLRP3炎性體的激活并未受明顯影響。說明ROS可能來源于另一重要途徑：線粒體ROS。其他研究證據(jù)表明：線粒體ROS是NLRP3炎性體激活所需的主要因素,線粒體功能障礙誘發(fā)NLRP3炎性體激活。另外我們發(fā)現(xiàn)VILI伴隨NLRP3炎性體激活。 機(jī)械牽張是否通過調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生影響NLRP3炎性體的激活呢?相關(guān)研究未見報(bào)道,據(jù)此,我們提出假說：機(jī)械牽張可能激活ROS依賴性NLRP3炎性體/炎性因子通路,最終導(dǎo)致肺損傷。研究目的 明確機(jī)械通氣對(duì)NLRP3炎性體活性的影響,并探討其作用機(jī)制；探討VILI中ROS對(duì)NLRP3炎性體活性的影響；明確ROS/NLRP3/炎性因子信號(hào)通路對(duì)VILI的調(diào)節(jié)作用。研究方法 本研究通過肺泡巨噬細(xì)胞、基因敲除小鼠、小鼠VILI模型等研究對(duì)象,采用Western Blot、siRNA轉(zhuǎn)染基因下調(diào)、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等手段,多層面探討機(jī)械通氣肺損傷中ROS/NLRP3炎性體/細(xì)胞因子IL-1p通路的調(diào)節(jié)作用,為探尋防治機(jī)械通氣肺損傷對(duì)策提供新的理論依據(jù)。第一部分機(jī)械牽張激活肺泡巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體/IL-1β信號(hào)通路1.1肺泡巨噬細(xì)胞分離提取和機(jī)械牽張 從C57BL/6J SD小鼠支氣管肺泡灌洗液分離收集肺泡巨噬細(xì)胞,將收集的AMs種植在6孔彈性底培養(yǎng)皿內(nèi)(BioFlex baseplate),培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的MCDB-131培養(yǎng)基(不含抗生素)；細(xì)胞種植密度為1.0×105/cm2,培養(yǎng)皿內(nèi)預(yù)鋪0.1%膠原蛋白Ⅳ,置于5%CO2-95%空氣的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)(37℃,飽和濕度)。 BioFlex培養(yǎng)皿固定在FX-4000T Flexercell田胞環(huán)形牽張儀(Flexcell International,McKeesport, PA)25-mm BioFlex承載臺(tái),進(jìn)行牽張模擬機(jī)械通氣,內(nèi)環(huán)境5%CO2-95%空氣(37℃,飽和濕度)。計(jì)算機(jī)設(shè)定牽張參數(shù),牽張頻率30cycles/min(0.5Hz),牽張/松弛比率1：1。培養(yǎng)皿底部牽張度分別設(shè)定為8、15、和20%,分別對(duì)應(yīng)機(jī)械通氣肺通氣量為50、64、80%的肺活量,牽張時(shí)間設(shè)為4h。不同牽張時(shí)間設(shè)定為0(對(duì)照)、1、2、4小時(shí),牽張度設(shè)為20%。 1.2siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù) 選擇合適siRNA下調(diào)相關(guān)基因表達(dá)：NLRP3/AIM2/IPAF。用無血清培養(yǎng)基稀釋siRNA和DharmaFECT轉(zhuǎn)染試劑,室溫孵育5分鐘,混合后室溫孵育20分鐘,加入無抗生素的完全培養(yǎng)基。換成轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,在37℃孵育24-48小時(shí)。設(shè)立轉(zhuǎn)染試劑、陰性、陽性對(duì)照。 1.3ELIS試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清pro-IL-1β、pro-1L-18、IL-1β和IL-18含量變化。 1.4Western Blo和IP檢測(cè)各組NLRP3/ASC/Caspase-1表達(dá)及相互作用、IL-1β和IL-18含量。 采用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞,提純后用BCA法測(cè)定蛋白濃度,然后用WB測(cè)定NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18含量等,最后用ImageJ軟件分析。 第二部分機(jī)械牽張激活NLRP3炎性體信號(hào)通路需要線粒體ROS 2.1分離C57BL/6J SD小鼠,gp91phox-/-小鼠AMs,不同組予以ROS抑制劑、激活劑,ROS熒光標(biāo)記試劑預(yù)處理后進(jìn)行機(jī)械牽張實(shí)驗(yàn)。 2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體ROS變化 避光10μM MitoSOX Red (Invitrogen-Molecular Probes)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)細(xì)胞30min,進(jìn)入各組牽張實(shí)驗(yàn)流程,然后胰蛋白酶-EDTA收集細(xì)胞,將各試驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞技術(shù)專用試管,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體ROS表達(dá),驗(yàn)證機(jī)械牽張是否通過線粒體ROS激活NLRP3炎性體。2.3Western Blot檢測(cè)NLRP3炎性體表達(dá) 采用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞,提純后用BCA法測(cè)定蛋白濃度,然后用WB測(cè)定NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18含量等,最后用ImageJ軟件分析。 2.4ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含量變化。 第三部分機(jī)械通氣對(duì)小鼠肺NLRP3炎性體的激活作用 3.1VILI模型建立 按照文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)方案,建立機(jī)械通氣肺損傷肺損傷模型。 3.2NLIP3炎性體表達(dá) 機(jī)械通氣后分別取各組支氣管肺泡灌洗液和肺組織,Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞裂解液中TLR4、NLRP3、ASC、Caspase-1以及pro-1L-1β、pro-IL-18、IL-1p和IL-18含量變化。ELISA法檢測(cè)各組支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-18含量變化。3.3線粒體ROS拮抗劑SS-31預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)小鼠SS-31霧化吸入預(yù)處理24h,機(jī)械通氣后分別取各組支氣管肺泡灌洗液和肺組織,Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞裂解液中TLR4、NLRP3、ASC、Caspase-1以及IL-1β和IL-18含量變化。Elisa法檢測(cè)各組支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-18含量變化。結(jié)果第一部分：機(jī)械牽張激活肺泡巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體/IL-1β信號(hào)通路 機(jī)械牽張引起肺泡巨噬細(xì)胞促炎因子IL-1β釋放,并隨牽張時(shí)間延長(zhǎng)、牽張程度增大而增強(qiáng)。CS誘發(fā)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞IL-1β釋放具有caspase-1依賴性。Caspase-1抑制劑明顯減少IL-1β含量。機(jī)械牽張激活小鼠肺泡巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體/IL-1β信號(hào)通路,而非其他炎性體通路。第二部分：機(jī)械牽張激活NLRP3炎性體信號(hào)通路需要線粒體ROS 機(jī)械牽張誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞線粒體ROS產(chǎn)生。機(jī)械牽張激活A(yù)Ms NLRP3炎性體需要線粒體ROS。NADPH氧化酶ROS未參與機(jī)械牽張所致NLRP3炎性體激活。機(jī)械牽張可能通過AMs尿酸釋放致線粒體ROS產(chǎn)生并激活NLRP3炎性體。第三部分：機(jī)械通氣激活小鼠肺ROS/NLRP3炎性體/IL-1β通路 高潮氣量機(jī)械通氣激活小鼠肺NLRP3炎性體。線粒體ROS抑制劑SS-31抑制機(jī)械通氣所致NLRP3炎性體激活,并降低IL-1β和IL-18產(chǎn)生量。通過肺泡巨噬細(xì)胞消減技術(shù)證明VILI中肺泡巨噬細(xì)胞起關(guān)鍵作用。IL-1β受體拮抗劑減輕機(jī)械通氣所致肺損傷炎性反應(yīng)。結(jié)論 機(jī)械牽張激活肺泡巨噬細(xì)胞線粒體ROS依賴性NLRP3炎性體信號(hào)通路并導(dǎo)致炎性因子IL-1β和IL-18釋放,是VILI早期的重要機(jī)制。 創(chuàng)新點(diǎn)及意義 本研究首次發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽張通過激活NLRP3炎性體誘導(dǎo)Caspase-1的活化及IL-1β和IL-18產(chǎn)生,并發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽張通過線粒體ROS通路激活NLRP3炎性體。本研究結(jié)果提示機(jī)械牽張可能通過激活NLRP3炎性體誘導(dǎo)免疫性肺損傷,RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)或藥物干預(yù)NLRP3活性、對(duì)VILI的早期治療有重要意義。本研究為VILI發(fā)病機(jī)制研究提供了新的思路,并為其臨床防治提供理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 宋宏濤;魏洪源;楚士晉;羅順忠;;酶模型[J];生物學(xué)雜志;2007年01期

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本文編號(hào)：2462353