發(fā)布時間：2017-02-17 21:22

  本文關(guān)鍵詞：環(huán)孢素A治療博來霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化及其機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第四軍醫(yī)大學(xué)》 2013年

小鼠肺間質(zhì)纖維化中巨噬細(xì)胞亞型誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化及CD147在其中的作用

耿杰杰  

【摘要】：背景 肺間質(zhì)纖維化是一種慢性的、漸進的肺間質(zhì)疾病，其特點是大量積累細(xì)胞外基質(zhì)，重塑肺結(jié)構(gòu)，并伴隨著嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎等并發(fā)癥。它是由多種原因引起的肺間質(zhì)的炎癥性疾病，病變主要累及肺間質(zhì)，也可累及肺泡上皮細(xì)胞及肺血管。肺間質(zhì)纖維化中一部分患者繼發(fā)于系統(tǒng)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多肌炎/皮肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎及混合結(jié)締組織病，，臨床上也很常見。大部分患肺纖維化的病人將會在3-8年內(nèi)死于呼吸衰竭。盡管肺間質(zhì)纖維化的患者死亡率很高，但是目前還沒有治療該疾病的有效方法，此病的發(fā)病機制及發(fā)展進程也不清楚。因此，加深對肺間質(zhì)纖維化機制，尤其是對其病程早期階段的認(rèn)識，是該病發(fā)病機制和治療研究亟待解決的問題。 輔助性T細(xì)胞17(Th17)是一種能夠分泌白介素17(IL-17)的T細(xì)胞亞群，在機體防御反應(yīng)和自身免疫性疾病中具有重要的意義。它是由Th0細(xì)胞在TGF-β、IL-1β、IL-6和IL-23的刺激下分化而成的輔助性T細(xì)胞，主要分泌IL-17、IL-22等促炎癥因子，RORγ是其重要的轉(zhuǎn)入因子。Th17細(xì)胞在多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機制中起非常重要的作用，如銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎性腸病和支氣管哮喘，近幾年來發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在肺間質(zhì)纖維化中也有非常重要的作用。 單核吞噬細(xì)胞前體經(jīng)微環(huán)境中某些微生物產(chǎn)物和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)能夠發(fā)生分化，并且因誘導(dǎo)因素不同而表現(xiàn)出不同表型和功能特點。它大體可分為兩種不同的亞型，即M1和M2型巨噬細(xì)胞，各亞型的功能差異很大。雖然國內(nèi)外已有很多文獻(xiàn)報道巨噬細(xì)胞能夠促進Th17細(xì)胞的分化，但是各亞型對Th17細(xì)胞的分化的作用還不是很明確。 在肺間質(zhì)纖維化中，某些細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上的CD147高表達(dá)，并且CD147可能促進肺纖維化的進程。已有文獻(xiàn)報道，CD147與細(xì)胞因子TGF-β、IL-6等也有一定關(guān)系，因此我們推斷CD147與Th17的分化也是有關(guān)系的。本課題旨在將肺間質(zhì)纖維化、巨噬細(xì)胞亞型、Th17細(xì)胞和CD147分子聯(lián)系起來，闡明肺間質(zhì)纖維化中M1、M2型巨噬細(xì)胞與Th17細(xì)胞分化之間的關(guān)系及機制，并研究清楚CD147在其中的作用。這將對炎癥的研究及治療起到一定的推動作用。 目的 建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型，并用HAb18G/CD147抗體治療，觀察小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞亞型和Th17細(xì)胞的數(shù)量變化；從肺間質(zhì)纖維化小鼠的肺組織中分離M1、M2型巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，并用HAb18G/CD147抗體封閉和慢病毒干涉CD147，觀察Th17細(xì)胞的分化情況，闡明肺間質(zhì)纖維化中M1、M2型巨噬細(xì)胞與Th17細(xì)胞分化之間的關(guān)系及機制，并研究清楚CD147在其中的作用。 方法和結(jié)果 1HAb18G/CD147抗體治療肺間質(zhì)纖維化小鼠及Th17細(xì)胞、M1、M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的變化 1.1肺間質(zhì)纖維化小鼠模型的建立及HAb18G/CD147抗體治療 9～11周齡的雌性C57BL/6小鼠隨機分為3組：模型組（BLM組）24只、HAb18抗體治療組和治療對照組，每組各6只。用氣管滴注法建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型，于造模次日起腹腔注射給藥，治療組用HAb18G/CD147抗體（10mg/kg），治療對照組予同體積的生理鹽水，每日1次。BLM組不予治療。 1.2檢測及研究 模型組于注射博來霉素后第4d、7d、14d、28d分批取材，每次每組6只，3只用于肺組織切片，3只用于研磨提取淋巴細(xì)胞。治療組和治療對照組于連續(xù)給藥后第14天取材。將小鼠組織塊置4%多聚甲醛/0.1PBS固定24h，經(jīng)脫水、石蠟包埋后，制作石蠟切片（切片厚度3μm），HE染色觀察肺組織炎癥改變，Masson染色觀察肺組織纖維化情況。取小鼠肺組織研磨消化后，加入5mL紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解10min，然后輕輕加到5mL小鼠淋巴細(xì)胞分離液（購于Mediatech）上層，2000rmp離心20min，吸取中間層的單核、淋巴細(xì)胞，用于流式分析。提取模型組和HAb18G/CD147抗體治療組的小鼠肺組織淋巴細(xì)胞的mRNA，進行Real-time PCR檢測。 1.3結(jié)果 1.3.1治療前及治療后小鼠肺組織病理觀察 第4d開始BLM組的肺泡間隔逐漸增寬，有少量淋巴細(xì)胞浸潤，也可見少量的、散在的中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞浸潤；第7d，肺間隔增寬明顯，炎癥反應(yīng)加重，有大量淋巴細(xì)胞、少量單核-巨噬細(xì)胞浸潤，膠原纖維沉積增多，第14d，見肺組織結(jié)構(gòu)破壞，瘢痕形成。對HAb18G/CD147抗體治療小鼠第14d時的肺組織進行切片，HE染色和Masson染色發(fā)現(xiàn)HAb18G/CD147抗體治療后，小鼠肺間質(zhì)炎癥明顯減輕，間質(zhì)內(nèi)及小支氣管周圍膠原纖維沉積減少。BLM組與治療對照組間相比均未見明顯差異。 1.3.2流式檢測治療前后M1、M2型巨噬細(xì)胞和Th17細(xì)胞的數(shù)量變化 流式檢測注射博來霉素后第4d、7d、14d、28d的小鼠肺組織中Th17細(xì)胞、M1、M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)隨著小鼠肺組織病變的增加，其Th17細(xì)胞、M1、M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加，在第14天時，達(dá)到最大值，第28天時，三種細(xì)胞的數(shù)量都有下降，其中Th17細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞下降的較多。 流式檢測模型組和HAb18G/CD147抗體治療組的小鼠肺組織中M1、M2型巨噬細(xì)胞和Th17細(xì)胞的數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過治療后的小鼠，M1型巨噬細(xì)胞略有下降，2.70%±0.45%~1.97%±0.36%；M2型巨噬細(xì)胞變化不明顯，4.80%±0.54%~4.94%±0.23%；Th17細(xì)胞明顯下降，3.24%±0.38%~1.50%±0.54%。 1.3.3Real-time PCR檢測治療前后小鼠肺組織淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞因子 提取模型組和HAb18G/CD147抗體治療組的小鼠肺組織淋巴細(xì)胞的mRNA，進行Real-time PCR，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過抗體治療后的小鼠TGF-β、IL-6、IL-1β都明顯下降，其中TGF-β下降將近一倍。 2肺間質(zhì)纖維化中M1、M2型巨噬細(xì)胞對Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)作用 2.1M1、M2型巨噬細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞的分離 取小鼠肺組織研磨消化后，加入5mL紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解10min，然后輕輕加到5mL小鼠淋巴細(xì)胞分離液（購于Mediatech）上層，2000rmp離心20min，吸取中間層的單核、淋巴細(xì)胞，用于流式分析和分選。 流式分選：將收取的單核、淋巴細(xì)胞用FITC-CD16/32，PE-CD206和PerCP-CD4標(biāo)記，室溫放置30min，用MOFLO流式分選儀分選。 2.2檢測及研究 分選之后的M1、M2型巨噬細(xì)胞分別與CD4T細(xì)胞共培養(yǎng)，并加入5ug/mlanti-CD3和10ug/ml anti-CD28刺激，三天后收集CD4T細(xì)胞用于流式分析。 流式分析：將共培養(yǎng)之后的CD4T細(xì)胞分離出來，在1uM莫能菌素條件下培養(yǎng)4小時，然后用PE-CCR6標(biāo)記胞外抗原，室溫放置30min；用BD Cytofix/Cytoperm和BD Perm/Wash kit固定破膜，F(xiàn)ITC-IFNγ，PE-IL-17和PerCP-RORγt標(biāo)記胞內(nèi)抗原，4℃放置半小時，PBS洗三遍，流式上機分析。 2.3結(jié)果 2.3.1M1、M2型巨噬細(xì)胞對Th17細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用 流式分析發(fā)現(xiàn)，在與M1共培養(yǎng)的CD4T細(xì)胞中，誘導(dǎo)成的CCR6、IL-17和RORγt分別是與M2共培養(yǎng)的CD4T細(xì)胞的~5(4.96%±0.46%to1.22%±0.21%),~3(3.87%±0.32%to1.24%±0.23%)和~4(2.54%±0.28%to0.60%±0.15%)。 2.3.2CD147在M1型巨噬細(xì)胞對Th17細(xì)胞分化的誘導(dǎo)中的作用 在M1型巨噬細(xì)胞與CD4T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，加入2ug/ml CD147/HAb18抗體封閉CD147,3天后，分離出CD4T細(xì)胞，進行CCR6染色，標(biāo)記出Th17細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)CCR6的表達(dá)水平在CD147/HAb18抗體封閉組中要低（1.84%±0.45%），而在未加抗體組中的表達(dá)水平要高（4.15%±0.68%）。同樣的結(jié)果，將用慢病毒干涉掉CD147的M1型巨噬細(xì)胞與CD4T細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CCR6的表達(dá)水平在慢病毒干涉組中要低（2.06%±0.48%），而在未干涉組中的表達(dá)水平要高（4.84%±0.72%）。 結(jié)論 本實驗發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞對Th17細(xì)胞的分化有正向促進作用，并且CD147通過調(diào)節(jié)促Th17細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，TGF-β、IL-6和IL-1β，促進該過程的發(fā)生。但是，Th17細(xì)胞分化是一個復(fù)雜的過程，涉及到多種不同的細(xì)胞和細(xì)胞因子，以后的實驗將會對CD147促進Th17細(xì)胞分化的機制進行進一步研究。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R563
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4 劉革修;歐大明;劉軍花;黃紅林;廖端芳;;丙丁酚在體外能抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)氧化介導(dǎo)的低密度脂蛋白氧化并調(diào)節(jié)氧化巨噬細(xì)胞的分泌功能[A];面向21世紀(jì)的科技進步與社會經(jīng)濟發(fā)展（下冊）[C];1999年

5 葉金善;楊麗霞;郭瑞威;;環(huán)氧化酶-2/前列腺素E_2在血管緊張素Ⅱ刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子中的作用[A];第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

6 秦帥;陳希;孔德明;;構(gòu)建由綠色熒光標(biāo)記巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系[A];貴州省中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝學(xué)術(shù)會論文匯編[C];2012年

7 武劍華;徐惠綿;;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在胃癌中的相關(guān)研究[A];第9屆全國胃癌學(xué)術(shù)會議暨第二屆陽光長城腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2014年

8 何軍;;血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體升高巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平[A];中華醫(yī)學(xué)會第11次心血管病學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

9 宋盛;周非凡;邢達(dá);;PDT誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞對巨噬細(xì)胞NO合成的影響[A];第七屆全國光生物學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2010年

10 張磊;朱建華;黃元偉;姚航平;;血管緊張素Ⅱ?qū)奘杉?xì)胞(THP-1重細(xì)胞)凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體表達(dá)的影響[A];浙江省免疫學(xué)會第五次學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2004年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 通訊員 李靜 記者 胡德榮;[N];健康報;2014年

2 蘭克;[N];科技日報;2000年

3 薛佳;[N];保健時報;2009年

4 記者 胡德榮;[N];健康報;2011年

5 侯嘉 何新鄉(xiāng);[N];中國食品質(zhì)量報;2003年

6 唐穎 倪兵 陳代杰;[N];中國醫(yī)藥報;2006年

7 劉元江;[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2007年

8 本報記者 侯嘉 通訊員 何新鄉(xiāng);[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

9 左志剛;[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2007年

10 記者 許琦敏;[N];文匯報;2011年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周赤燕;巨噬細(xì)胞MsrA對動脈粥樣硬化的干預(yù)研究[D];武漢大學(xué);2013年

2 章桂忠;TIPE2蛋白調(diào)控細(xì)胞增殖和炎癥的機制研究[D];山東大學(xué);2015年

3 張瑜;DKK1抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及其相關(guān)分子機制[D];山東大學(xué);2015年

4 孟濤;異丙酚對心臟收縮功能的抑制作用及其對巨噬細(xì)胞分泌功能調(diào)節(jié)的機制研究[D];山東大學(xué);2015年

5 周興;基于酵母微囊構(gòu)建新型口服巨噬細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 蔣興偉;Tim-3對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

7 劉伯玉;清道夫受體A介導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬鉤端螺旋體研究[D];上海交通大學(xué);2013年

8 楊紹俊;miRNA-155介導(dǎo)ESAT-6誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的分子機制及其在結(jié)核診斷中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

9 翟光耀;單核/巨噬細(xì)胞Ly6C~(low)亞群在心肌梗死后瘢痕形成期的抗炎特性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

10 韓露;TRB3介導(dǎo)的脂肪組織巨噬細(xì)胞極化與糖尿病冠狀動脈病變關(guān)系的研究[D];山東大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馬春梅;AP0E~(-/-)小鼠TLR9介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化效應(yīng)對動脈粥樣硬化作用的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 張譯丹;鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑調(diào)控巨噬細(xì)胞表型對實驗性矽肺的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 盧文冉;HCV core蛋白作用的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清對肝細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 李文建;載脂蛋白E影響巨噬細(xì)胞因子表達(dá)及分型的機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 曹爽;高糖對巨噬細(xì)胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 寧程程;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在子宮內(nèi)膜癌雌激素敏感性中的作用及機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

7 高龍;PLD4在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞抑制結(jié)腸癌增殖中的作用研究[D];成都醫(yī)學(xué)院;2015年

8 任虹;感染期子宮頸癌U14細(xì)胞荷瘤小鼠抑制巨噬細(xì)胞CCL5分泌的機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

9 李美玲;雙酚A對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化影響的體外研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

10 劉瓊;黃芪多糖影響巨噬細(xì)胞向脂肪細(xì)胞趨化的作用及機制研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

  本文關(guān)鍵詞：環(huán)孢素A治療博來霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化及其機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：243612