【摘要】：[目的]本研究組的先前研究證實,間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過細(xì)胞旁分泌的方式釋放足量的角質(zhì)細(xì)胞生長因子,這些生長因子在調(diào)節(jié)肺水清除率以及減輕肺水腫的過程中起了決定性作用。目前發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞能夠釋放一種100納米至1微米大小的膜微粒,這種類球型的無核顆粒包涵了眾多來自于干細(xì)胞的蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA、細(xì)胞器以及脂質(zhì)等成分,已經(jīng)證實這些微粒在參與細(xì)胞間信號傳遞的過程中起了關(guān)鍵作用。鑒于這些線索,我們假定微�？赡懿糠滞ㄟ^傳遞角質(zhì)細(xì)胞生長因子的mRNA至受損的肺泡上皮及肺內(nèi)皮細(xì)胞從而保護(hù)急性肺損傷,擬通過本研究證實這一可能的作用機(jī)制。 [方法](1)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放微粒的分離提純：將間充質(zhì)干細(xì)胞置于條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時后收集上清。經(jīng)過超高速離心后分離微粒,按照10μ1微粒相當(dāng)于1×106的間充質(zhì)干細(xì)胞的比例提純微粒。(2)內(nèi)毒素所致小鼠急性肺損傷模型的建立：小鼠經(jīng)氣管內(nèi)給予內(nèi)毒素(4mg/kg)建立急性肺損傷模型。按照不同的處理進(jìn)行分組：內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞氣管給藥治療組(LPS+MSC);內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞微粒靜脈給藥治療組(LPS+1×MSCMVIV);內(nèi)毒素+單倍劑量間充質(zhì)干細(xì)胞微粒氣管給藥治療組(LPS+1×MSCMVIT);內(nèi)毒素+雙倍劑量間充質(zhì)干細(xì)胞微粒氣管給藥治療組(LPS+2×MSCMVIT);內(nèi)毒素+成纖維細(xì)胞微粒氣管給藥治療組(LPS+NHLF MV)。(3)標(biāo)本的采集和檢測：48小時后對各組小鼠的外周血、肺泡灌洗液、肺組織進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)研究。利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清及肺泡灌洗液中的MIP-2濃度,并用二辛可寧酸法測定肺泡灌洗液中的蛋白含量。(4)用KGF siRNA干擾處理間充質(zhì)干細(xì)胞來干擾細(xì)胞釋放的微粒中的KGF mRNA:行RT-PCR證實。(5)接著,用KGFsiRNA干擾微粒處理急性肺損傷小鼠模型：將小鼠隨機(jī)分為內(nèi)毒素組(4mg/kg);內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞KGF siRNA干擾預(yù)處理微粒氣管給藥治療組(LPS+KGF siRNA MV)；內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞Negative siRNA干擾預(yù)處理微粒氣管給藥治療組(LPS+Negative siRNA MV)。(6)標(biāo)本的采集和檢測：48小時后對各組小鼠的外周血、肺泡灌洗液、肺組織進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究以及肺血管外水含量的檢測。(7)小鼠肺巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞微粒的體外共培養(yǎng)：在不同時間點(6小時、12小時、24小時)收集培養(yǎng)液上清,用ELISA測定MIP-2、TNF-α、及IL-10的濃度。(8)統(tǒng)計學(xué)方法：用SPSS及Prism統(tǒng)計軟件,變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組計量資料間比較采用one-way ANOVA分析及Bonferroni校正檢驗分析,兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗,以P0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。 [結(jié)果](1)經(jīng)氣管給予人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒能減少小鼠急性肺損傷模型肺泡灌洗液中白細(xì)胞的聚集：與單純內(nèi)毒素組相比,內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞微粒組肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)下降36%,P0.05；內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞微粒組肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計數(shù)亦下降73%,P0.05。(2)經(jīng)氣管給予人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒能抑制小鼠急性肺損傷模型肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞因子的釋放以及蛋白的滲出：與單純內(nèi)毒素組相比,內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞微粒組肺泡灌洗液中MIP-2含量下降49%,P0.05；內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞微粒組肺泡灌洗液中總蛋白含量亦下降35%,P0.05。(3)經(jīng)靜脈給予人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒同樣能減少小鼠急性肺損傷模型肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞并抑制蛋白的滲出：與單純內(nèi)毒素組相比,內(nèi)毒素+間充質(zhì)干細(xì)胞微粒靜脈給藥組的肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計數(shù)下降49%,同時總蛋白含量亦下降34%,P0.05。(4)經(jīng)氣管給予人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放微粒的劑量效應(yīng)：當(dāng)氣管給予雙倍劑量間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒時,肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞及MIP-2含量較之單倍劑量的微粒僅有輕度下降,無統(tǒng)計學(xué)差異。(5)LPS體外刺激RAW264.7細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞及微粒共培養(yǎng)不同時間后上清液炎癥因子的變化：與單純LPS刺激組相比,干細(xì)胞組及微粒組在共培養(yǎng)6小時后IL-10水平明顯上升,有統(tǒng)計學(xué)差異。12小時后,微粒組仍然較單純LPS組明顯升高。但24小時后,干細(xì)胞組及微粒組的IL-10水平回復(fù)至單純LPS組水平；微粒組在共培養(yǎng)6小時后TNF-α水平明顯下降,有統(tǒng)計學(xué)差異。12小時后,干細(xì)胞組及微粒組TNF-α水平均有減少,且趨勢持續(xù)至24小時；微粒組在共培養(yǎng)6小時后MIP-2水平明顯下降,有統(tǒng)計學(xué)差異。12小時后,干細(xì)胞組及微粒組MIP-2水平均有減少,且趨勢持續(xù)至24小時,變化趨勢類似于TNF-α。(6) KGF siRNA干擾處理的間充質(zhì)干細(xì)胞微粒對于急性肺損傷小鼠模型的作用：與內(nèi)毒素+Negative siRNA干擾預(yù)處理微粒組相比,內(nèi)毒素+KGFsiRNA干擾預(yù)處理微粒組肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計數(shù)上升47%；內(nèi)毒素+KGFsiRNA干擾預(yù)處理微粒組肺泡灌洗液中MIP-2含量上升56%。(7)急性肺損傷小鼠模型肺血管外水含量的變化：與單純內(nèi)毒素組相比,給予間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒組的肺血管外水含量減少45%,其保護(hù)作用類似于間充質(zhì)干細(xì)胞組；與內(nèi)毒素+Negative siRNA干擾預(yù)處理微粒組相比,內(nèi)毒素+KGF siRNA干擾預(yù)處理微粒組的肺血管外水含量增加24%。 [結(jié)論](1)在內(nèi)毒素所致的小鼠急性肺損傷模型中,無論是靜脈還是氣管給藥,人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒能抑制炎癥細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞)的聚集,減少炎癥因子(如MIP-2)的釋放以及肺泡內(nèi)蛋白的滲出；(2)更重要的是,給予間充質(zhì)干細(xì)胞微粒能減少肺血管外水含量(反映肺水腫的指標(biāo))；(3)間充質(zhì)干細(xì)胞釋放微粒的保護(hù)作用類似于間充質(zhì)干細(xì)胞本身；(4)間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒包涵KGF mRNA,之前的研究已經(jīng)證實KGF是間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的因子,參與維持肺泡內(nèi)液體清除的功能；(5)無論是靜脈還是氣管給予間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微粒,肺泡灌洗液中KGF蛋白的含量均明顯升高；(6)經(jīng)KGF siRNA干擾處理的間充質(zhì)干細(xì)胞微粒,其保護(hù)作用部分消失,結(jié)果提示微�？赡懿糠滞ㄟ^傳遞KGF mRNA至受損的肺泡上皮細(xì)胞及肺內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)KGF蛋白的釋放來達(dá)到保護(hù)的作用；(7)體外試驗亦證實間充質(zhì)干細(xì)胞微粒能抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的促炎癥因子的釋放,同時促進(jìn)抗炎因子如IL-10的釋放,結(jié)果提示微粒具有類似于間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R563

【共引文獻(xiàn)】

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1 李蓓;角質(zhì)化細(xì)胞生長因子對內(nèi)毒素致大鼠急性肺損傷防護(hù)作用的研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2013年

2 唐科;微顆粒在脂氧素合成和腫瘤治療中的作用[D];華中科技大學(xué);2013年

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2 莫璐霞;抑制KGFR表達(dá)對高氧暴露下A549細(xì)胞功能影響的研究[D];華中科技大學(xué);2013年

3 馮娜娜;醫(yī)院獲得性銅綠假單胞菌肺炎死亡率相關(guān)性研究及角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2治療銅綠假單胞菌肺炎的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

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本文編號：2422191