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  本文關鍵詞：Th17細胞在哮喘發(fā)病中作用機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南方醫(yī)科大學》 2009年

Th17細胞在哮喘發(fā)病中作用機制的研究

龔雨新  

【摘要】： 研究背景 支氣管哮喘是一種以氣道高反應性和慢性氣道炎癥為主要特征的變態(tài)反應性疾病,其發(fā)病機制尚未完全明了。較統(tǒng)一的觀點認為哮喘是多種細胞如上皮細胞、成纖維細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞引起的慢性氣道炎癥。支氣管痙攣、黏膜水腫、黏液分泌物充滿氣道是哮喘患者急性發(fā)作的一個重要環(huán)節(jié)。在哮喘炎癥中T淋巴細胞發(fā)揮著重要的免疫調節(jié)作用,Th2占優(yōu)勢的Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的一個重要機制,Th2細胞分泌細胞因子IL-4、IL-13、IL-5和IL-9,其中IL-4和IL-13促使B細胞生產(chǎn)IgE,IL-5促進骨髓嗜酸性粒細胞的分化,IL-9能趨化肥大細胞并引起肥大細胞的分化,這些細胞因子在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用。但是,這個理論并不能完全解釋哮喘全部的病理生理過程。新近研究發(fā)現(xiàn),機體存在一種新型的不同于1型和2型的效應T細胞—輔助性17細胞(T help 17,Th17)亞群。該細胞是由天然T細胞前體Th0分化而來,具有與Th1和Th2細胞不同的獨立的分化和發(fā)育調節(jié)機制,其在促炎癥反應和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。該細胞亞群能夠特異性地產(chǎn)生效應因子白細胞介素(IL)-17,而不產(chǎn)生IFN-γ,和IL-4,因此被稱為Th17亞群。由于具有促炎性作用,也被稱為炎癥性T細胞(inflammatory T cell)。Th17細胞亞群的分化和功能均受Th1和Th2細胞因子的調控。IL-6和轉化生長因子B(TGF-β)聯(lián)合作用能誘導初始T細胞分化成Th17細胞,提示后者在哮喘等炎癥性疾病中同樣具有一定作用。IL-17A是IL-17家族的一個特殊亞型,由Th17細胞亞群特異性產(chǎn)生,IL-17A由含有一個N-末端信號肽的155個氨基酸組成并由二硫鍵連接的同型二聚體糖蛋白。作為一種前炎癥因子,IL-17A可以誘導氣道上皮細胞及成纖維細胞增加表達多種細胞因子,如IL-6,IL-8,G-CSF,GM-CSF及粒細胞趨化蛋白-2(GCP-2),共同催化多種炎癥細胞在氣道內浸潤,這些細胞相互作用又可以分泌多種炎癥細胞因子,構成炎癥細胞及炎癥因子之間的復雜網(wǎng)絡,從而形成氣道的慢性炎癥。但對IL-17A及Th17細胞在哮喘發(fā)病中作用機制的了解還不多,本研究擬通過小鼠哮喘模型觀察Th17細胞和Th17細胞特異性產(chǎn)生的IL-17A在體內的表達情況,初步探索Th17細胞和IL-17A在哮喘發(fā)病機制中的作用。 第一部分小鼠哮喘模型的建立 目的探討建立OVA致敏和激發(fā)的BALB/c小鼠哮喘模型。 方法SPF級雌性BALB/c小鼠(南方醫(yī)科大學實驗動物中心)24只,4-6周齡,體重18～20g,隨機分為2組,每組12只,A組為正常對照組,B組為哮喘模型組。B組小鼠于實驗流程第0、14d給予腹腔注射含OVA 2mg和乳化的氫氧化鋁5mg的生理鹽水混懸液200μl致敏;第21d開始先給予1%OVA生理鹽水200μl滴鼻激發(fā),隨后給予2%OVA生理鹽水霧化液40ml經(jīng)超聲霧化器霧化吸入,每天1次,每次持續(xù)約40min,連續(xù)6d。A組以生理鹽水代替致敏液及霧化液,方法同B組。在最后一次激發(fā)1h后,摘取小鼠眼球放血后將其頸椎脫臼處死,兩組小鼠各隨機選取6只行支氣管肺泡灌洗術。將回收的BALF涂片,固定,HE染色,光學顯微鏡下進行細胞總數(shù)和分類的計數(shù)。細胞分類至少計數(shù)400個細胞,求出各類細胞所占百分比。兩組小鼠各各隨機選取6只行開胸取肺組織,置于10%中性甲醛固定液中固定。常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、制備石蠟切片、HE染色。中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)、氣道上皮損傷、氣管及血管周圍嗜酸性粒細胞浸潤情況,拍片。 結果 1.激發(fā)過程小鼠行為學觀察:模型組小鼠出現(xiàn)不同程度的頭面部瘙癢,前肢搔鼻,煩躁不安,然后俯伏不動,口唇紫紺,呼吸急促,腹肌抽搐,二便失禁等癥狀;而正常組小鼠無此癥狀。 2.BALF中細胞總數(shù)和分類比較:①BALF細胞總數(shù):A組BALF細胞總數(shù)為(0.62+0.43)×10~5/ml,B組BALF細胞總數(shù)為(1.41士0.13)×10~5/ml,B組BALF細胞總數(shù)顯著高于A組(P＜0.01)。②BALF嗜酸性粒細胞和中性粒細胞百分率:A組BALF嗜酸性粒細胞和中性粒細胞百分率分別為0.83%±1.18%和5.67%±1.42%,B組BALF嗜酸性粒細胞和中性粒細胞百分率分別為和25.42%±4.05%和29.63%±4.91%,B組BALF嗜酸性粒細胞和中性粒細胞百分率顯著高于A組(P＜0.01)。 3.市組織病理觀察結果:哮喘模型組支氣管及血管周圍大量炎性細胞浸潤,肺間質及肺泡腔內可見中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞浸潤,氣道上皮損傷,結構紊亂,氣道內杯狀細胞肥大增生,氣道內分泌大量黏液并有粘液栓形成,粘膜下膠原纖維沉積。對照組肺組織氣道結構清晰,氣道纖毛上皮排列整齊,無明顯的炎癥改變及膠原纖維沉積。 結論BALB/c小鼠經(jīng)OVA和乳化的氫氧化鋁腹腔注射致敏后,采用滴鼻聯(lián)合霧化激發(fā)的方法成功建立小鼠哮喘模型,更加符合哮喘氣道的病理生理改變。 第二部分Th17細胞在哮喘發(fā)病中作用機制的研究 目的初步探索Th17細胞在哮喘發(fā)病中的作用機制。 方法30只SPF級雌性BALB/c小鼠隨機均分為2組,每組15只,A組為正常對照組,B組為哮喘模型組。哮喘模型的制作過程同第一部分內容。觀察2組小鼠BALF中細胞比例變化和氣道病理改變;外周血通過摘眼球采取,肝素化處理,胸腺及肺組織用眼科剪剪成小塊后,篩網(wǎng)上研磨成單個細胞,制作單細胞懸液,在外周血、胸腺細胞懸液和肺組織細胞懸液中分別加入適當?shù)哪芫匾?置于5%的CO_2、37℃孵育箱培養(yǎng)5h,經(jīng)過紅細胞裂解、多聚甲醛固定、皂素破膜等處理后,加入抗小鼠的FITC-CD4和PE-IL-17A抗體行細胞表面及胞內抗原染色,最后加0.5ml染色液重懸細胞,流式細胞術檢測外周血、胸腺和肺組織中Th17細胞。 結果哮喘組BALF細胞總數(shù)和中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞百分率均顯著高于對照組(P＜0.01)。病理觀察可見哮喘組小鼠的氣道炎癥以中性粒細胞及嗜酸性粒細胞浸潤為主,而對照組無此變化。哮喘組外周血、脾臟及胸腺中Th17細胞(分別為3.62%±0.58%、4.22%±0.69%、6.96%±1.35%)顯著增高,與對照組(分別為0.68%±0.26%、0.76%±0.31%、0.80%±0.30%)比較有顯著性差異(P＜0.01);而肺組織中Th17細胞很少,哮喘組(0.64%±0.30%)與對照組(0.55%±0.23%)相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。哮喘模型組血漿中Th17的水平與BALF中嗜中性粒細胞及嗜酸性粒細胞呈正相關(分別為r=0.933,P=0.007:r=0.861,P=0.028)。 結論Th17細胞參與了哮喘的發(fā)病機制,在哮喘中的作用可能是在胸腺分化成熟后,通過胸腺組織釋放入外周血及其它組織中,并且外周血Th17細胞與氣道嗜酸性粒細胞及中性粒細胞呈正相關,從而參與哮喘氣道炎癥的發(fā)生,對哮喘發(fā)病機制進行了補充和完善。 第三部分白介素-17A在哮喘小鼠中的表達及意義 目的初步探討哮喘小鼠中血清白介素(IL)-17A的水平及在其在肺、脾及胸腺組織中的表達情況。 方法28只BALB/c雌性SPF級小鼠隨機分為正常對照組(A組,14只)和哮喘模型組(B組,14只),哮喘模型的制作過程同第一部分內容。觀察兩組小鼠氣道病理改變及BALF中各組細胞比例的變化;外周血通過摘眼球采取,肝素化處理,肺、脾及胸腺組織用眼科剪剪成小塊后,篩網(wǎng)上研磨成勻漿,外周血及肺、脾、胸腺組織懸液分別置于5%的CO_2、37℃孵育箱培養(yǎng)24h后,以3000r/min離心10min,將上清液保存在—20℃冰箱用作IL-17A的測定。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測兩組小鼠血清IL-17A水平及肺、脾和胸腺組織勻漿預孵后的表達情況。 結果B組BALF細胞總數(shù)和中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞百分率均顯著高于A組(P＜0.01)。病理觀察可見B組小鼠的氣道炎癥以中性粒細胞及嗜酸性粒細胞浸潤為主,而A組無此變化。IL-17A在A組小鼠血清及肺、脾、胸腺組織勻漿中的濃度分別為10.94±5.02(×10pg/ml),13.63±4.07(×10pg/g),16.37±9.85(×10pg/g),22.45±10.89(×10pg/g),IL-17A在B組小鼠血清及肺、脾、胸腺組織勻漿中的濃度分別為52.23±19.08(×10pg/ml),52.98±10.81(×10pg/g).54.77±10.80(×10pg/g),86.68±10.29(×10pg/g)。IL-17A在B組小鼠血清及肺、脾、胸腺組織勻漿中的表達水平顯著增高,與A組相比差異均有顯著性意義(P＜0.01)。B組肺組織中IL-17A水平與BALF中中性粒細胞和嗜酸性粒細胞呈正相關(分別為r=0.832,P=0.040;r=0.856,P=0.030)。 結論IL-17A在哮喘小鼠血清及肺、脾及胸腺組織中高表達,并且肺組織IL-17A與哮喘氣道中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞呈正相關,IL-17A可能是參與支氣管哮喘急性發(fā)作的主要細胞因子之一,在哮喘中的作用與其促進中性粒細胞及嗜酸性粒細胞在氣道內聚集有關,從而參與哮喘氣道炎癥。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R562.25
【目錄】：

摘要3-8

ABSTRACT8-15

前言15-20

第一部分 小鼠哮喘模型的建立20-33

1 材料與方法20-25

2 結果25-28

3 討論28-30

參考文獻30-33

第二部分 Th17細胞在哮喘發(fā)病中作用機制的研究33-45

1 材料與方法33-36

2 結果36-40

3 討論40-41

參考文獻41-45

第三部分 白介素-17A在哮喘小鼠中的表達及意義45-55

1 材料與方法45-47

2 結果47-50

3 討論50-52

參考文獻52-55

全文小結55-56

攻讀學位期間成果56-57

綜述57-66

致謝66-69

統(tǒng)計學核稿證明69

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  本文關鍵詞：Th17細胞在哮喘發(fā)病中作用機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：240670