本文關(guān)鍵詞：Th17細(xì)胞在哮喘發(fā)病中作用機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南方醫(yī)科大學(xué)》 2009年

Th17細(xì)胞在哮喘發(fā)病中作用機(jī)制的研究

龔雨新  

【摘要】： 研究背景 支氣管哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性和慢性氣道炎癥為主要特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病,其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。較統(tǒng)一的觀點(diǎn)認(rèn)為哮喘是多種細(xì)胞如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞引起的慢性氣道炎癥。支氣管痙攣、黏膜水腫、黏液分泌物充滿氣道是哮喘患者急性發(fā)作的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。在哮喘炎癥中T淋巴細(xì)胞發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用,Th2占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制,Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-13、IL-5和IL-9,其中IL-4和IL-13促使B細(xì)胞生產(chǎn)IgE,IL-5促進(jìn)骨髓嗜酸性粒細(xì)胞的分化,IL-9能趨化肥大細(xì)胞并引起肥大細(xì)胞的分化,這些細(xì)胞因子在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用。但是,這個(gè)理論并不能完全解釋哮喘全部的病理生理過(guò)程。新近研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體存在一種新型的不同于1型和2型的效應(yīng)T細(xì)胞—輔助性17細(xì)胞(T help 17,Th17)亞群。該細(xì)胞是由天然T細(xì)胞前體Th0分化而來(lái),具有與Th1和Th2細(xì)胞不同的獨(dú)立的分化和發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制,其在促炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。該細(xì)胞亞群能夠特異性地產(chǎn)生效應(yīng)因子白細(xì)胞介素(IL)-17,而不產(chǎn)生IFN-γ,和IL-4,因此被稱為Th17亞群。由于具有促炎性作用,也被稱為炎癥性T細(xì)胞(inflammatory T cell)。Th17細(xì)胞亞群的分化和功能均受Th1和Th2細(xì)胞因子的調(diào)控。IL-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B(TGF-β)聯(lián)合作用能誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞,提示后者在哮喘等炎癥性疾病中同樣具有一定作用。IL-17A是IL-17家族的一個(gè)特殊亞型,由Th17細(xì)胞亞群特異性產(chǎn)生,IL-17A由含有一個(gè)N-末端信號(hào)肽的155個(gè)氨基酸組成并由二硫鍵連接的同型二聚體糖蛋白。作為一種前炎癥因子,IL-17A可以誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增加表達(dá)多種細(xì)胞因子,如IL-6,IL-8,G-CSF,GM-CSF及粒細(xì)胞趨化蛋白-2(GCP-2),共同催化多種炎癥細(xì)胞在氣道內(nèi)浸潤(rùn),這些細(xì)胞相互作用又可以分泌多種炎癥細(xì)胞因子,構(gòu)成炎癥細(xì)胞及炎癥因子之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),從而形成氣道的慢性炎癥。但對(duì)IL-17A及Th17細(xì)胞在哮喘發(fā)病中作用機(jī)制的了解還不多,本研究擬通過(guò)小鼠哮喘模型觀察Th17細(xì)胞和Th17細(xì)胞特異性產(chǎn)生的IL-17A在體內(nèi)的表達(dá)情況,初步探索Th17細(xì)胞和IL-17A在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。 第一部分小鼠哮喘模型的建立 目的探討建立OVA致敏和激發(fā)的BALB/c小鼠哮喘模型。 方法SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)24只,4-6周齡,體重18～20g,隨機(jī)分為2組,每組12只,A組為正常對(duì)照組,B組為哮喘模型組。B組小鼠于實(shí)驗(yàn)流程第0、14d給予腹腔注射含OVA 2mg和乳化的氫氧化鋁5mg的生理鹽水混懸液200μl致敏;第21d開(kāi)始先給予1%OVA生理鹽水200μl滴鼻激發(fā),隨后給予2%OVA生理鹽水霧化液40ml經(jīng)超聲霧化器霧化吸入,每天1次,每次持續(xù)約40min,連續(xù)6d。A組以生理鹽水代替致敏液及霧化液,方法同B組。在最后一次激發(fā)1h后,摘取小鼠眼球放血后將其頸椎脫臼處死,兩組小鼠各隨機(jī)選取6只行支氣管肺泡灌洗術(shù)。將回收的BALF涂片,固定,HE染色,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)和分類的計(jì)數(shù)。細(xì)胞分類至少計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞,求出各類細(xì)胞所占百分比。兩組小鼠各各隨機(jī)選取6只行開(kāi)胸取肺組織,置于10%中性甲醛固定液中固定。常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、制備石蠟切片、HE染色。中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)、氣道上皮損傷、氣管及血管周圍嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況,拍片。 結(jié)果 1.激發(fā)過(guò)程小鼠行為學(xué)觀察:模型組小鼠出現(xiàn)不同程度的頭面部瘙癢,前肢搔鼻,煩躁不安,然后俯伏不動(dòng),口唇紫紺,呼吸急促,腹肌抽搐,二便失禁等癥狀;而正常組小鼠無(wú)此癥狀。 2.BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類比較:①BALF細(xì)胞總數(shù):A組BALF細(xì)胞總數(shù)為(0.62+0.43)×10~5/ml,B組BALF細(xì)胞總數(shù)為(1.41士0.13)×10~5/ml,B組BALF細(xì)胞總數(shù)顯著高于A組(P＜0.01)。②BALF嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分率:A組BALF嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分率分別為0.83%±1.18%和5.67%±1.42%,B組BALF嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分率分別為和25.42%±4.05%和29.63%±4.91%,B組BALF嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分率顯著高于A組(P＜0.01)。 3.市組織病理觀察結(jié)果:哮喘模型組支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),氣道上皮損傷,結(jié)構(gòu)紊亂,氣道內(nèi)杯狀細(xì)胞肥大增生,氣道內(nèi)分泌大量黏液并有粘液栓形成,粘膜下膠原纖維沉積。對(duì)照組肺組織氣道結(jié)構(gòu)清晰,氣道纖毛上皮排列整齊,無(wú)明顯的炎癥改變及膠原纖維沉積。 結(jié)論BALB/c小鼠經(jīng)OVA和乳化的氫氧化鋁腹腔注射致敏后,采用滴鼻聯(lián)合霧化激發(fā)的方法成功建立小鼠哮喘模型,更加符合哮喘氣道的病理生理改變。 第二部分Th17細(xì)胞在哮喘發(fā)病中作用機(jī)制的研究 目的初步探索Th17細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的作用機(jī)制。 方法30只SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠隨機(jī)均分為2組,每組15只,A組為正常對(duì)照組,B組為哮喘模型組。哮喘模型的制作過(guò)程同第一部分內(nèi)容。觀察2組小鼠BALF中細(xì)胞比例變化和氣道病理改變;外周血通過(guò)摘眼球采取,肝素化處理,胸腺及肺組織用眼科剪剪成小塊后,篩網(wǎng)上研磨成單個(gè)細(xì)胞,制作單細(xì)胞懸液,在外周血、胸腺細(xì)胞懸液和肺組織細(xì)胞懸液中分別加入適當(dāng)?shù)哪芫匾?置于5%的CO_2、37℃孵育箱培養(yǎng)5h,經(jīng)過(guò)紅細(xì)胞裂解、多聚甲醛固定、皂素破膜等處理后,加入抗小鼠的FITC-CD4和PE-IL-17A抗體行細(xì)胞表面及胞內(nèi)抗原染色,最后加0.5ml染色液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血、胸腺和肺組織中Th17細(xì)胞。 結(jié)果哮喘組BALF細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞百分率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。病理觀察可見(jiàn)哮喘組小鼠的氣道炎癥以中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主,而對(duì)照組無(wú)此變化。哮喘組外周血、脾臟及胸腺中Th17細(xì)胞(分別為3.62%±0.58%、4.22%±0.69%、6.96%±1.35%)顯著增高,與對(duì)照組(分別為0.68%±0.26%、0.76%±0.31%、0.80%±0.30%)比較有顯著性差異(P＜0.01);而肺組織中Th17細(xì)胞很少,哮喘組(0.64%±0.30%)與對(duì)照組(0.55%±0.23%)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。哮喘模型組血漿中Th17的水平與BALF中嗜中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞呈正相關(guān)(分別為r=0.933,P=0.007:r=0.861,P=0.028)。 結(jié)論Th17細(xì)胞參與了哮喘的發(fā)病機(jī)制,在哮喘中的作用可能是在胸腺分化成熟后,通過(guò)胸腺組織釋放入外周血及其它組織中,并且外周血Th17細(xì)胞與氣道嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞呈正相關(guān),從而參與哮喘氣道炎癥的發(fā)生,對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了補(bǔ)充和完善。 第三部分白介素-17A在哮喘小鼠中的表達(dá)及意義 目的初步探討哮喘小鼠中血清白介素(IL)-17A的水平及在其在肺、脾及胸腺組織中的表達(dá)情況。 方法28只BALB/c雌性SPF級(jí)小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組,14只)和哮喘模型組(B組,14只),哮喘模型的制作過(guò)程同第一部分內(nèi)容。觀察兩組小鼠氣道病理改變及BALF中各組細(xì)胞比例的變化;外周血通過(guò)摘眼球采取,肝素化處理,肺、脾及胸腺組織用眼科剪剪成小塊后,篩網(wǎng)上研磨成勻漿,外周血及肺、脾、胸腺組織懸液分別置于5%的CO_2、37℃孵育箱培養(yǎng)24h后,以3000r/min離心10min,將上清液保存在—20℃冰箱用作IL-17A的測(cè)定。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)兩組小鼠血清IL-17A水平及肺、脾和胸腺組織勻漿預(yù)孵后的表達(dá)情況。 結(jié)果B組BALF細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞百分率均顯著高于A組(P＜0.01)。病理觀察可見(jiàn)B組小鼠的氣道炎癥以中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主,而A組無(wú)此變化。IL-17A在A組小鼠血清及肺、脾、胸腺組織勻漿中的濃度分別為10.94±5.02(×10pg/ml),13.63±4.07(×10pg/g),16.37±9.85(×10pg/g),22.45±10.89(×10pg/g),IL-17A在B組小鼠血清及肺、脾、胸腺組織勻漿中的濃度分別為52.23±19.08(×10pg/ml),52.98±10.81(×10pg/g).54.77±10.80(×10pg/g),86.68±10.29(×10pg/g)。IL-17A在B組小鼠血清及肺、脾、胸腺組織勻漿中的表達(dá)水平顯著增高,與A組相比差異均有顯著性意義(P＜0.01)。B組肺組織中IL-17A水平與BALF中中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞呈正相關(guān)(分別為r=0.832,P=0.040;r=0.856,P=0.030)。 結(jié)論IL-17A在哮喘小鼠血清及肺、脾及胸腺組織中高表達(dá),并且肺組織IL-17A與哮喘氣道中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈正相關(guān),IL-17A可能是參與支氣管哮喘急性發(fā)作的主要細(xì)胞因子之一,在哮喘中的作用與其促進(jìn)中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞在氣道內(nèi)聚集有關(guān),從而參與哮喘氣道炎癥。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R562.25
【目錄】：

摘要3-8

ABSTRACT8-15

前言15-20

第一部分 小鼠哮喘模型的建立20-33

1 材料與方法20-25

2 結(jié)果25-28

3 討論28-30

參考文獻(xiàn)30-33

第二部分 Th17細(xì)胞在哮喘發(fā)病中作用機(jī)制的研究33-45

1 材料與方法33-36

2 結(jié)果36-40

3 討論40-41

參考文獻(xiàn)41-45

第三部分 白介素-17A在哮喘小鼠中的表達(dá)及意義45-55

1 材料與方法45-47

2 結(jié)果47-50

3 討論50-52

參考文獻(xiàn)52-55

全文小結(jié)55-56

攻讀學(xué)位期間成果56-57

綜述57-66

致謝66-69

統(tǒng)計(jì)學(xué)核稿證明69

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5 李開(kāi)艷;Th17細(xì)胞亞群在支氣管哮喘中的發(fā)病機(jī)制及TLR2對(duì)Th17細(xì)胞分化的調(diào)控研究[D];華中科技大學(xué);2011年

6 陳馨馨;仙味保金方治療過(guò)敏性支氣管哮喘的代謝組學(xué)研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

7 張永明;呼出氣一氧化氮檢測(cè)在慢性咳嗽診治中的應(yīng)用價(jià)值[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

8 楊沫毅;急性哮喘小鼠中T-bet通過(guò)IL-23受體對(duì)Th17細(xì)胞增殖和致炎機(jī)能的影響[D];中南大學(xué);2010年

9 張旃;IL-22對(duì)氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞作用的初步探討[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

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【相似文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：Th17細(xì)胞在哮喘發(fā)病中作用機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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